Author(s): Pinto, Isa Eunice Costa Figueiredo Paula
Date: 2014
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/5663
Origin: uBibliorum
Subject(s): Adenosine A1 Receptor; Cgmp; Hippocampus; Phosphodiesterase; Protein Kinase G; Soluble Guanylyl Cyclase; Synaptic Transmission; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química
The adenosine A1 receptor is highly expressed in hippocampus where it inhibits synaptic transmission and has neuroprotective activity. Similar actions are obtained by increasing the concentration of the second messenger cGMP and recently it was found that activation of adenosine A1 receptor increased cGMP levels in the nervous system, but the role of cGMP on adenosine A1 receptor mediated inhibition of synaptic transmission remains to be established. This work addressed if the adenosine A1 receptor inhibitory effect on neurotransmission is dependent on the cGMP pathway. To answer this question investigated in what extent increasing the levels of cGMP (with a phosphodiesterases inhibitor and a cGMP analog), or blocking the cGMP pathway (using nitric oxide synthase, protein kinase G and soluble guanylyl cyclase inhibitors) modify the inhibitory effect of an A1 receptor agonist on synaptic transmission. The hippocampal slice was used as an experimental model and neurotransmission evaluated through extracelular electrophysiological recording technique, specifically by measuring the slope of field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) evoked by electrical stimulation. N6-cyclopentyladenosine (CPA, 15nM), a selective adenosine A1 receptor agonist, reversibly decreased the fEPSPs by 48% ± 2.1% (n=5; P<0.05). Incubation of the slices with a phosphodiesterase inhibitor Bay 60-7550 (100 nM), in order to prevent cGMP degradation, did not modify the CPA (15 nM) inhibitory effect on fEPSPs (50%±2.8%, n=5; P>0.05 when compared with CPA alone). The presence of a membrane-permeable analog of cGMP, 8-pCPTP-cGMP (10 µM), also did not significantly affect (P>0.05) the CPA (15nM) inhibitory effect on fEPSPs (59.0%±4.5% in the absence and 50%±8.6% in the presence of 8-pCTP-cGMP, n=4). On the other hand, inhibition of nitric oxide synthase (NOS) by L-NAME (200 µM) decreased (P<0.05) the CPA (15nM) inhibitory effect on fEPSPs (54%±5.3% in the absence and 23%±5.7% in the presence of L-NAME, n=5, female rats). In male rats, the presence of a Protein Kinase G (PKG) inhibitor (KT5823, 1nM) decreased the inhibitory effect of CPA (15nM) on fEPSPs by 45.0%±8.9% (n=4, P<0.05 compared with zero); similar results were obtained in females. Finally the effect of an inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC), ODQ (10 µM), on the CPA (15 nM) inhibitory action on fEPSPs was investigated. In males ODQ decreased (P<0.05) the CPA inhibitory effect (50%±4.3% in the absence and 39%±6.0% in the presence of ODQ, n=4), but only when adenosine deaminase (1 U/ml) was present; similar results were found in females. In conclusion, the results strongly suggest that inhibitory action of adenosine A1 receptors on glutamatergic neurotransmission at the hippocampus is, at least partially, mediated by activation of the NOS/sGC/cGMP/PKG pathway.
A adenosina é libertada para o meio extracelular em situação de actividade neuronal prolongada ou após insulto neurotóxico. A adenosina, via activação do receptor A1, inibe a transmissão sináptica e previne o dano neuronal causado por isquémia, excitotocicidade ou episódios epiléticos. Os receptores A1 diminuem a neurotransmissão quer pré-sinapticamente, por inibibição da libertação de glutamato, quer pós-sinapticamente, por activação dos canais de potássio que provocam hiperpolarização dos neurónios pós-sinápticos. Os receptores A1 produzem este efeito inibitório através da modulação de vários efectores e mensageiros intracelulares, tais como o cAMP, canais de cálcio e potássio e fosfatos de inositol. O cGMP é produzido pelas ciclases do guanililo que são uma família de enzimas que convertem o GTP em cGMP. Existem dois tipos de ciclases do guanililo: a forma solúvel (sGC) activada pelo oxido nítrico e a forma particulada, a qual constitui um receptor membranar para ligandos extracelulares como o péptido natriurético. O cGMP é degradado por acção de fosfodiesterases que catalisam a hidrólise do cGMP e também do cAMP (algumas formas), desempenhando um importante papel na regulação da via dos nucleótidos cíclicos e na comunicação celular. O cGMP através da activação da cinase G de proteínas (PKG) diminui a transmissão sináptica reduzindo a actividade neuronal e exerce uma acção neuroprotectora face a insultos neurotóxicos. Uma via importante que modula os níveis de cGMP no cérebro em resposta à atividade sináptica é a via oxido nítrico/sGC. O oxido nitrico age como mensageiro retrogrado, uma vez que além de activar a ciclase do guanililo solúvel em neurónio pós-sinápticos pode difundir para o meio extracelular e pré-sinapticamente estimular a sGC produzindo cGMP diminuindo assim a libertação de glutamato. Estudos anteriores mostraram que doadores de oxido nítrico inibiram a transmissão sináptica em fatias de hippocampo e essa inibição foi bloqueada por antagonistas do receptor A1 (Boulton et al., 1994; Broome et al., 1994). Em contraste, a inibição da ciclase do guanililo solúvel não afectou o efeito inibitório do doador de oxido nitrico na transmisão sináptica (Arrigoni et al., 2006). Por outro lado, o óxido nítrico mostrou aumentar o efeito inibitório da 2-chloroadenosine (CADO) na transmissão sináptica e esse aumento foi bloqueado por inibidores da sGC (Fragata et al., 2006). No entanto, o papel do cGMP na mediação do efeito inibitório do receptor A1 na transmissão sináptica permanece por esclarecer. Observámos recentemente que a activação do receptor A1 aumenta a formação de cGMP no cérebro. Com o presente projecto pretende-se investigar se o efeito inibitório do receptor A1 na transmissão sináptica glutamatérgica serão mediados, pelo menos em parte, pela via do cGMP. Para responder à questão anterior investigou-se em que medida fármacos que aumentam os níveis de cGMP (e.g. inibidor de fosfodiesterases e análogo do cGMP) ou que bloqueiem a via do cGMP (e.g. inibidores da sintase do óxido nítrico, da PKG e da sGC) modificarão o efeito de um agonista selectivo do receptor A1 na transmissão sináptica. A fatia de hipocampo de rato foi utilizada como modelo experimental. A neurotransmissão foi avaliada por electrofisiologia através do registo e medição do declive dos potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (fEPSPs) evocados por estimulação eléctrica. A N6-ciclopentiladenosina (CPA, 15 nM), um agonista selectivo do receptor A1 de adenosina diminuiu reversivelmente os fEPSPs em 48% ± 2,1% (n = 5, P<0,05). A incubação das fatias com um inibidor de fosfodiesterases, o Bay 60-7550 (100 nM), a fim de evitar a degradação do cGMP, não alterou o efeito inibitório da CPA (15 nM) nos fEPSPs (50% ± 2,8%, n = 5, P>0,05 quando comparado com a CPA sozinha). A presença de um análogo do cGMP permeável à membrana, o 8-pCPTP-cGMP (10 µM), também não afectou significativamente (P>0,05) o efeito inibitório da CPA (15 nM) nos fEPSPs (59% ± 4,5%, na ausência e 50% ± 8,6% na presença de 8-PCTP-cGMP, n = 4). Por outro lado, a inibição da sintase do óxido nítrico (NOS) pelo L-NAME (200 µM) diminuiu (P<0,05) o efeito inibitório da CPA (15 nM) nos fEPSPs (54% ± 5,3 % na ausência e 23% ± 5,7% na presença de L-NAME, n = 5, ratos fêmeas). Em ratos machos, a presença de um inibidor (KT5823, 1 nM) da PKG diminuiu o efeito inibitório do CPA (15 nM) nos fEPSPs em 45.0%±8.9% (n=4, P<0,05 comparado com zero); resultados semelhantes também foram obtidos em fêmeas. Finalmente, o efeito de um inibidor da ciclase do guanililo solúvel, o ODQ (10 µM), na acção inibitória da CPA (15 nM) nos fEPSPs foi investigado. Em machos o ODQ diminuiu (P<0,05) o efeito inibitório da CPA (50% ± 4,3%, na ausência e 39% ± 6,0% na presença de ODQ, n=4), mas apenas quando a desaminase da adenosina (1 U/ml) estava presente; resultados semelhantes foram obtidos em fêmeas. Em conclusão, os resultados sugerem que a acção inibitória dos receptores A1 da adenosina na neurotransmissão glutamatérgica ao nível do hipocampo é, pelo menos em parte, mediada pela activação da via NOS/sGC/cGMP/PKG.
