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Biosynthesis and isolation of STEAP1 protein from Escherichia coli cells lysates

Author(s): Pais, João Pedro Vicente

Date: 2016

Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/5806

Origin: uBibliorum

Subject(s): Biossíntese; Cancro da Próstata; Escherichia Coli; Imac.; Proteínas Membranares; Steap1; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química


Description

Prostate cancer is one of the most frequent cancers diagnosed in last years, around the world, and the most common in Europe, mainly in northern and western Europe, where affects more than 200 men in 100.000. In Portugal, the Urology National Association refers to this type of cancer as the most common in adult men but also refers that a precocious detection, increase the treatment success rate to 85%. It is the second cause of death by cancer, and is the most frequent in men over 50 years. The therapies used nowadays are inefficient and limited and do not provide the efficient treatment of this disease. So, new approaches must be assessed and new therapies must be developed to increase the rate of cure. In order to achieve this goal, new molecules arise with a potential role in prostate cancer pathogenesis. The six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1 (STEAP1) was found overexpressed in cancer tissues, namely, in prostate cancer cases. The location of this proteins in cell membrane and the six transmembrane domains suggests a role in cell-cell communication, mediating the transport of ions and small molecules. Additionally, its overexpression in cancer cell lines, associated with its topology, makes this protein a promising therapeutic target for immunotherapy. Thus, structural and interaction studies are required, and to achieve that, large amount of highly purified proteins are required. Therefore, the main goal of this work is to develop a laboratorial platform for the STEAP1 protein biosynthesis, solubilization and purification. The obtained results showed that the use of SOB medium, with IPTG at 1.25 mM as inducer after 5h of fermentation and using DMSO at 1.5% (v/v) are the ideal conditions for the biosynthesis of recombinant STEAP1 protein, in small scale. Moreover, applying lactose as inducer may influence the compartmentalization of the target membrane protein and promote its solubility. Concerning the IMAC purification step, a nickel and a cobalt charged columns were used, with different imidazole concentrations in binding step, in order to promote the compete retention of the target biomolecule. Although, several host proteins from E.coli elute along the STEAP1 protein, being necessary additional optimizations in order to obtain a purified STEAP1 sample.

O cancro da próstata é um dos cancros mais frequentemente diagnosticado nos últimos anos em todo o mundo e o mais comum na Europa, principalmente na região norte e ocidental, onde afeta mais de duzentos homens por 100.000. Em Portugal, a Associação Nacional de Urologia refere-se a este tipo de cancro como o mais comum em homens adultos, mas também refere que uma deteção precoce incrementa a taxa de sucesso no tratamento poderia atingir 85%. É a segunda causa de morte por cancro e é mais frequente em homens com mais de cinquenta anos. As terapias usadas atualmente são ineficientes e limitadas e não permitem o correto tratamento eficaz desta doença. Assim, novas abordagens ter devem ser avaliadas e novas terapias devem ser desenvolvidas de modo a aumentar a taxa de cura. De modo a alcançar esse objetivo, novas moléculas têm surgido com elevado potencial na patogénese do cancro da próstata. A proteína six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1 (STEAP1) foi identificada como estando sobrexpressa em tecidos cancerígenos, designadamente em casos de cancro da próstata. A localização desta proteína na membrana celular e os seis domínios transmembranares sugerem uma participação na comunicação celular, mediando o transporte de iões e pequenas moléculas. Adicionalmente, a sobrexpressão em linhas celulares tumorais e a sua topologia tornam esta proteína um promissor alvo terapêutico para imunoterapia no cancro da próstata. Assim, torna-se essencial o desenvolvimento de estudos estruturais e de interação, de forma a obter uma elevada quantidade de proteína altamente purificada. Assim, o objetivo principal deste trabalho é desenvolver uma plataforma laboratorial para a biossíntese, solubilização e purificação da proteína STEAP1. Os resultados obtidos demostraram que o uso de meio de cultura SOB, com IPTG a 1,25 mM como indutor após 5h de fermentação e com DMSO em 1,5% (v/v) são as condições ideais para a biossíntese da proteína STEAP1, em pequena escala. Adicionalmente, a aplicação de lactose como indutor influencia a compartimentalização da proteína alvo e promove a sua solubilidade. Na etapa de solubilização, os resultados obtidos demonstraram que a proteína STEAP1 é eficazmente solubilizada com uma concentração de 1% de Triton X-100. Relativamente à etapa de purificação por IMAC, foram testadas colunas carregadas com níquel e cobalto, com diferentes concentrações de imidazol, nomeadamente 5, 7, 8.5 e 10 mM no passo de ligação, de modo a promover a retenção completa da proteína alvo. Dos perfis obtidos consta-se que várias proteínas do hospedeiro E.coli eluem juntamente com a proteína STEAP1, sendo assim necessárias otimizações adicionais por forma de obter uma amostra purificada da proteína STEAP1.

Document Type Master thesis
Language English
Advisor(s) Baptista, Cláudio Jorge Maia; Passarinha, Luis António Paulino
Contributor(s) Pais, João Pedro Vicente
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