Author(s): Gomes, Ana Inês Pacheco Vaz
Date: 2016
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/5808
Origin: uBibliorum
Subject(s): Cyp2c9 Inhibition; Drug Interactions; Flavonoids; Heparg Cells; Highperformance Liquid Chromatography; In Vitro Studies; Tolbutamide; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química
Pharmacokinetics information, especially regarding the drug metabolic profile, is a requirement during the preclinical and clinical development. In vitro methodologies represent more and more useful tools to predict drug safety and toxicity. The cytochrome P450 (CYP450) enzymes are the main responsible for the variability in pharmacokinetics and drug response, being the cytochrome (CYP) 2C9 isoform representative of about 20% of total hepatic CYP450 content, and one of the most important drug-metabolizing isoenzymes. Consequently, the prediction of drug interactions mediated by the inhibition of the CYP2C9 isoenzyme may be of great relevance in the development of new drugs. Due to the fact that HepaRG, a new human cell line derived from a hepatocellular carcinoma, is being considered a promising model to evaluate the in vitro metabolism of drugs, it was herein used for the development of an in vitro methodology for the investigation of CYP2C9 inhibition-based metabolic drug-drug interactions. The high-performance liquid chromatography–diode-array detection (HPLC-DAD) assay developed, enabled the simultaneously quantification of tolbutamide (TOL) and its metabolite 4-hydroxytolbutamide (4-OH-TOL), in HepaRG cell culture medium samples, supporting the subsequent in vitro studies. Chromatographic separation of the analytes (4-OH-TOL and TOL) and the internal standard (IS), carbamazepine (CBZ), was achieved in less than 20 minutes by a gradient elution on a reversed-phase LiChroCART® Purospher Star column (C18, 55 mm × 4 mm; 3 µm particle size), at 35 °C, using a mobile phase composed of phosphate buffer (10 mM) with 0.1% triethylamine (pH 3)/acetonitrile pumped at 0.6 mL/min. The analytes and IS were detected at 230 nm. The method proved to be selective, accurate, precise and linear (r2 = 0.9901) over the concentration ranges of 0.25-200 µM for TOL and 0.25-20 µM for 4-OH-TOL. Furthermore, the absolute recovery of the analytes ranged from 73.2 to 84.8% and their stability was demonstrated in the studied conditions. HepaRG cells were used in the metabolic inhibition studies, in which the reference drugs used as CYP2C9 inhibitors (amiodarone, fluoxetine, ketoconazole, omeprazole and ticlopidine) or flavonoids [baicalein, (-)-epigallocatechin gallate, kaempferol and quercetin] were pre-incubated for 30 minutes, and then TOL (200 µM), a known CYP2C9 probe drug, was co-incubated with the CYP2C9 inhibitors or flavonoids (24 hours). The suitability of the in vitro technique and the experimental analytical procedures developed and validated in the evaluation of potential metabolic inhibition interactions involving the CYP2C9 was demonstrated by the inhibitory effect observed with almost all the concentrations of CYP2C9 inhibitors. Moreover, all the flavonoids also demonstrated to inhibit the CYP2C9 isoenzyme, with exception of baicalein at 50 µM, validating the methodology applicability. This work demonstrated the usefulness of the in vitro assay developed and validated in the HepaRG cell line as a useful in vitro approach to foresee metabolic interactions involving the CYP2C9 isoenzyme inhibition.
Informação farmacocinética, principalmente em relação ao perfil metabólico dos fármacos, é uma exigência durante o desenvolvimento pré-clínico e clínico. Metodologias in vitro representam cada vez mais ferramentas úteis para prever a segurança e a toxicidade dos fármacos. As enzimas do sistema citocromo P450 (CYP450) são as principais responsáveis pela variabilidade na farmacocinética e na resposta aos fármacos, representando o citocromo (CYP) 2C9 cerca de 20% do conteúdo total de CYP450 hepáticos, sendo uma das isoenzimas mais relevantes na etapa de metabolização. Problemas relacionados com as suas características farmacocinéticas estão entre as principais razões para o fracasso no desenvolvimento de fármacos, estando estes problemas muitas vezes associados a interações farmacológicas. Por conseguinte, a previsão das interações ao nível do metabolismo mediadas pela inibição do CYP2C9 pode ser de grande relevância no desenvolvimento de novos fármacos. Durante os últimos anos foram desenvolvidos vários modelos in vitro e ex vivo para o estudo do metabolismo hepático de fármacos, pois o fígado é o órgão principal responsável pelo metabolismo. As células HepaRG, uma nova linha celular derivada de um carcinoma hepatocelular humano, são consideradas cada vez mais um modelo promissor na avaliação do metabolismo in vitro. Assim, este foi o modelo escolhido para o desenvolvimento e validação de uma metodologia in vitro para a investigação de interações metabólicas mediadas pela inibição do CYP2C9. O método de cromatografia líquida de alta resolução acoplado a um detetor de fotodíodos (HPLC-DAD) desenvolvido, permitiu a quantificação simultânea da tolbutamida (TOL) e do seu metabolito 4-hidroxitolbutamida (4-OH-TOL), em amostras de meio de cultura de células HepaRG, suportando assim os estudos in vitro subsequentes. A separação cromatográfica dos analitos (4-OH-TOL e TOL) e do padrão interno (PI), carbamazepina (CBZ), foi conseguida em menos de 20 min, com o uso de uma eluição por gradiente e de uma coluna cromatográfica LiChroCART® Purospher Star de fase reversa (C18, 55 mm × 4 mm; 3 µm tamanho da partícula), a 35 °C, utilizando uma fase móvel composta por tampão fosfato (10 mM) com 0,1% de trietilamina (pH 3)/acetonitrilo a um fluxo de 0,6 mL/min. Os analitos e o PI foram detetados a um comprimento de onda de 230 nm. O método descrito provou ser seletivo, exato, preciso, e linear (r2 = 0,9901) numa gama de concentrações de 0,25-200 µM para a TOL, e de 0,25-20 µM para a 4-OH-TOL. Além disso, a recuperação absoluta dos analitos variou entre 73,2 e 84,8%, e a estabilidade das amostras foi comprovada nas diferentes condições utilizadas, simulando o manuseamento e armazenamento das amostras. A citotoxicidade dos inibidores de referência do CYP2C9 (amiodarona, fluoxetina, cetoconazol, omeprazol, ticlopidina) e dos compostos flavonoides [baicaleina, (-)-epigalocatequina galato, kaempferol, e quercetina] foi também avaliada, permitindo obter uma maior segurança na posterior interpretação dos resultados referentes aos estudos metabólicos. As células HepaRG foram utilizadas nos estudos metabólicos de inibição, tendo sido os inibidores de referência do CYP2C9 e os flavonoides pré-incubados durante 30 minutos. De seguida a TOL (200 µM), uma sonda conhecida do CYP2C9, foi co-incubada com os inibidores de referência do CYP2C9 ou flavonoides (24 horas). A adequação da técnica in vitro e dos procedimentos analíticos e experimentais, desenvolvidos e validados na avaliação de potenciais interações que envolvem a inibição metabólica do CYP2C9, foi demonstrada através do efeito inibitório observado mediado pelos inibidores de referência do CYP2C9 a quase todas as concentrações testadas. Além disso, os flavonoides demonstraram também um efeito inibitório sobre a isoenzima CYP2C9, com exceção da baicaleina a 50 µM, validando assim a aplicabilidade da metodologia. Este trabalho demonstrou a utilidade do modelo in vitro desenvolvido e validado com a linha celular HepaRG, na previsão de interações metabólicas envolvendo a inibição da isoenzima CYP2C9.
