Author(s): Carapito, Duarte Gonçalves
Date: 2016
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/5818
Origin: uBibliorum
Subject(s): Cromatografia de Afinidade; Hpv; Monolito de Cadaverina; Monolito de Lisina; Vacinas de Dna Plasmídico.; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências Biomédicas
Human papillomavirus (HPV) is a common sexually transmitted virus responsible for malignant progression of cervical cancer. High-risk HPVs have been reported in 99% of cervical cancer cases worldwide, the second most common cancer in women. The cervical cancer development is associated with HPV E6 and E7 protein production, which can interfere with apoptosis and deregulate cell cycle proliferation. Nowadays, prophylactic vaccines are available and commercialized towards HPV eradication. However, these vaccines only stimulate the immune system against future infections, being ineffective when the woman is already infected. Furthermore, not all types of HPV virus are covered by this type of vaccines. DNA vaccines are advantageous compared to conventional vaccines by inducing both cellular and humoral immune responses, leading to prevention and treatment of a target infection. Thus, the development of a DNA vaccine able to produce E6 and E7 antigens arises as a promising therapeutic pathway to control HPV infection. Plasmid DNA (pDNA) has been explored as a versatile non-viral vector to deliver therapeutic genes due to its biosafety, low cost and easy manufacture, which make it a desirable vector to deliver therapeutic genes. In order to guarantee the purity of the pDNA vaccine, it is necessary to explore several chromatographic methods. Our research group has been focused on the purification of mutated pDNA HPV-16 E6/E7, to prevent oncogenecity of E6 and E7 viral proteins, in order to achieve the required purity levels imposed by regulatory agencies for therapeutic applications. In addition, interest around innovative monolithic supports has recently increased due to their advantageous features, like high binding capacities of large molecules and excellent mass transfer properties. Thus, the aim of the present work was to explore two monolithic columns modified with lysine and cadaverine ligands, in order to develop suitable purification strategies to isolate supercoiled (sc) pDNA isoform, which is the conformation with most biological interest for therapeutic applications. Through the manipulation of NaCl concentrations, buffer nature and pHs, the chromatographic conditions were optimized to isolate sc pDNA in cadaverine and lysine monolithic columns. The results obtained with cadaverine and lysine monoliths from purity degree (97.89% and 97.53%, respectively) and recovery yield (98.70% and 96.10%, respectively) of sc pDNA, revealed that the best elution strategy consists on an increasing stepwise gradient of NaCl in 10 mM tris-EDTA (pH 6.0). It was also observed that lower pH values led to stronger interaction between ligands and biomolecules, favoring the sc pDNA purification. The results of genomic DNA, endotoxins and proteins quantification, revealed that all impurities had levels below to those imposed by regulatory agencies. These data suggest the applicability of two supports to purify sc pDNA in order to be applied on a DNA vaccine against HPV.
A infeção pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV) é sexualmente transmissível e está associada ao desenvolvimento de vários tipos de cancro, entre eles o cancro do colo do útero, a segunda maior causa de morte em mulheres a nível mundial. A patogenicidade do vírus advém da capacidade de alterar o ciclo celular através das oncoproteínas E6 e E7, responsáveis pela proliferação descontrolada das células infetadas e consequente desenvolvimento de massas tumorais. Apesar da existência de três vacinas disponíveis no mercado (Cervarix, Gardasil e Gardasil 9), a sua função é apenas preventiva, através do desenvolvimento de respostas imunes humorais, não tendo a capacidade de tratar pacientes já infetados aquando da sua administração. Além desta desvantagem, as vacinas preventivas não abrangem imunidade contra todos os tipos de vírus do HPV. Como tal, o desenvolvimento de uma vacina terapêutica é considerada uma estratégia promissora que tem vindo a ser cada vez mais estudada. O crescente conhecimento acerca dos mecanismos das doenças juntamente com a facilidade em manipular o DNA, tem aumentado o desenvolvimento na área do DNA recombinante ao longo das últimas décadas, nomeadamente nas abordagens de terapia génica e de vacinas de DNA. O baixo custo destas terapias torna-as acessíveis e cada vez mais exploradas pela ciência. Assim, a utilização de vetores virais e não virais para a entrega de genes, tem vindo a ganhar importância como meio de prevenção e tratamento, através da expressão de proteínas alvo. Entre os vetores não virais mais explorados, destaca-se o DNA plasmídico (pDNA) pela sua segurança, fácil manipulação e possível produção em grande escala. As vacinas de DNA fazem uso deste vetor e das suas vantagens, no sentido de desencadear uma resposta preventiva e terapêutica eficaz contra doenças infeciosas. A expressão de proteínas antigénicas leva ao desenvolvimento das respostas imunitárias humoral e celular, evitando a progressão da doença e permitindo a sua regressão. Para se tornarem eficazes, estas vacinas de DNA requerem elevadas quantidades de pDNA superenrolado (sc), considerada a forma biologicamente ativa do pDNA, com elevado grau de pureza de forma a aumentar a eficiência de transfeção das células alvo e da expressão das proteínas antigénicas. O desenvolvimento de um processo biotecnológico para a produção da vacina de pDNA HPV E6/E7MUT foi estabelecido, sendo fundamental explorar estratégias de purificação eficientes, aplicando suportes cromatográficos vantajosos e inovadores de forma a obter o pDNA sc com o grau de pureza recomendado pelas agências reguladoras. A cromatografia de afinidade tem vindo a ser explorada para a purificação de pDNA, nomeadamente através da utilização de aminoácidos como ligandos. Este tipo de ligandos permitem explorar interações específicas e seletivas com o pDNA sc, à semelhança do que acontece em sistemas biológicos no bioreconhecimento entre proteínas e ácidos nucleicos. Este bioreconhecimento resulta na obtenção de um produto biofarmacêutico final com elevado grau de pureza. Devido às limitações das matrizes convencionais, os monolitos surgem como suportes cromatográficos cada vez mais explorados. Através da sua estrutura polimerizada, formam canais tridimensionais, interconectados entre si e de largo diâmetro, possuem uma elevada capacidade de ligação para biomoléculas com grandes dimensões (como o pDNA) e permitem realizar processos de purificação rápidos e eficientes, mesmo em suportes de pequenas dimensões. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo explorar as características e a versatilidade dos suportes monolíticos, modificados com dois ligandos semelhantes, a lisina e a cadaverina, no sentido de tentar obter a purificação da isoforma sc do pDNA, removendo contaminantes provenientes do processo de produção e extração do pDNA a partir das células bacterianas, como as isoformas menos funcionais do pDNA (linear e circular aberta) e os constituintes do hospedeiro (DNA genómico, proteínas e endotoxinas). Após vários estudos do comportamento de retenção e eluição do pDNA sc presente na amostra de lisado por variação da concentração de NaCl com diferentes tampões no monolito de cadaverina, verificou-se que tanto o tampão Tris-EDTA como o Fosfato-EDTA mostraram alguma seletividade na separação entre o pDNA e o RNA. No entanto, foram necessários mais testes combinando com estes tampões a manipulação de pHs, para obter a purificação do pDNA sc. Foi otimizada uma estratégia de eluição através de um gradiente por passos com concentrações crescentes de 1.05 para 1.5 M de NaCl em tampão Tris-EDTA, pH 6.0, que permitiu isolar o pDNA sc com um grau de pureza de 97.89% e uma recuperação de 98.70%. Com o sucesso obtido no suporte monolítico de cadaverina, as melhores condições foram também testadas no monolito de lisina. A estratégia otimizada para o monolito de lisina consistiu num gradiente por passos com concentrações crescentes de 0.45 M para 1 M de NaCl em tampão Tris-EDTA, a pH 6.0, sendo que os resultados obtidos neste suporte em termos de grau de pureza e rendimento de recuperação do pDNA sc foram semelhantes aos resultados alcançados no monolito de cadaverina (97.53% e 96.10% respetivamente). Para verificar se as amostras obtidas nos monolitos de cadaverina e lisina com melhor valor de pureza e rendimento para o pDNA sc cumprem os requisitos exigidos pelas agências reguladoras, foi realizada uma análise detalhada por PCR em tempo real, micro BCA e ensaios de LAL com o objetivo de quantificar impurezas como o DNA genómico, proteínas e endotoxinas, respetivamente. As amostras selecionadas apresentaram níveis de impurezas abaixo dos limites recomendados pela Food and Drug Administration. Embora o monolito de lisina permita a purificação do pDNA sc aplicando menores quantidades de sal, o que se torna vantajoso devido ao menor impacto ambiental, o suporte de cadaverina permitiu obter melhores níveis de pureza e recuperação, tal como melhor eficiência na remoção de impurezas. Assim, pode concluir-se que as estratégias de purificação otimizadas para ambos os suportes permitem obter devidamente o pDNA sc para aplicação como um produto biofarmacêutico.
