Author(s): Santos, Bruno Fernandes dos
Date: 2015
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/5962
Origin: uBibliorum
Subject(s): Alergia A Fungos; Alternaria Alternata; Cromatografia; Purificação; Serina Proteases; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências Biomédicas
Alternaria alternata is a common environmental allergenic fungi. The prevalence of Alternaria allergies varies in different geographic regions. A multicenter study performed in a group of almost 900 patients with allergies found hypersensitivity to Alternaria in 3–20% of the individuals (3 % in Portugal to 20 % in Spain). To date, 17 allergens of A. alternata have been identified. Different studies demonstrated the existence of A. alternata serine proteases that can induce lung inflammation and airway epithelial cell activation via PAR2. In 2014, the Alt a 15 (recombinant A. alternata serine protease) was added to allergens list of the official Allergen nomenclature subcommittee. In the present project, we aimed to purify the native serine protease from the A. alternata extract since this form is very important for carrying out characterization studies and to provide a good foundation for improving the accuracy of the diagnosis and the understanding and management of IgE-mediated fungal diseases. The purification protocol involved a first step of affinity chromatography using a Concanavalin A Sepharose column and a second purification step of ion exchange chromatography using a DEAE-Sepharose column. A global 28.03-fold purification of serine protease was obtained with a specific activity of 144.33 U/mg. The molecular weight of the enzyme was determined as 40 kDa by using SDS-PAGE, and the optimum pH and temperature were 8.0 and 50º C, respectively. The kinetic parameters KM and Vmax, determined against substrate casein, were 0.51 mg/mL and 7.38 µmol/min/mL, respectively. The protease was strongly inhibited by PMSF (phenylmethyl sulfony fluorid) indicating it is a serine protease. The purification strategy applied in this work could be of great importance to open a new possibility for obtaining native A. alternata serine proteases for application in diagnosis or clinical purposes.
Nos últimos anos, tem vindo a aumentar a prevalência das doenças alérgicas em especial nos países industrializados. Estudos indicam que cerca de um terço da população ocidental sofre de uma ou mais formas de doenças alérgicas. De uma maneira simples, a doença alérgica pode ser definida como uma reação exacerbada do sistema imunitário contra determinados antigénios presentes no meio ambiente (alergénios), mas que na verdade não representam qualquer perigo para indivíduos não sensibilizados. Este tipo de doença está normalmente associada a uma produção aumentade de IgE específica para um determinado alergénio, sendo que a tendência pessoal ou familiar para a produção exacerbada deste tipo de imunoglobulina é denominada de atopia. De entre as fontes alergénicas ambientais capazes de induzir reações de hipersensibilidade, os fungos surgem como um dos principais responsáveis pelo desenvolvimento, persistência e severidade de doença alérgica respiratória, nomeadamente da asma e da rinite. A Alternaria alternata é uma das principais espécies fúngicas associadas a doenças alérgicas tendo, até a data, sido identificados 17 alergénios diferentes para esta espécie. A prevalência de alergias devido à Alternaria varia em diferentes regiões geográficas. Um estudo multicêntrico realizado num grupo de quase 900 doentes com alergias mostrou que 3-20% dos indivíduos (3% em Portugal e 20% em Espanha) apresentava hipersensibilidade a A. alternata. Em estudos recentes foi verificado que um dos alergénios da A. alternata, o Alt a 15, apresentava um homólogo para a Curvularia lunata, C l 4. Indivíduos sensíveis a um destes alergénios apresentava uma resposta alérgica quando exposta ao outro alergénio, ou seja, apresentavam uma resposta alérgica cruzada. O Alt a 15 é uma serina protease descoberta por clonagem do mRNA de A. alternata, não sendo conhecida ainda a sua forma nativa. Apesar de se conhecer a sua massa molecular e de se tratar de uma glicoproteína, a caracterização da Alt a 15 ainda está muito incompleta, sendo difícil estudar esta proteína e assim conseguir mais informação sobre possíveis reações alérgicas cruzadas com outros fungos. Assim, este trabalho tem como objetivo purificar e caracterizar a forma nativa desta serina protease da A. alternata. A purificação desta proteína foi realizada utilizando um processo constituído por duas etapas cromatográficos. Na primeira foi utilizada uma coluna de Concanavalina A (Con A) Sepharose. Esta coluna cromatográfica apresenta afinidade específica para moléculas glicosiladas, tais como glicoproteínas e glicolípidos, tendo sido utilizada anteriormente na purificação da serina protease da C. lunata. A coluna foi inicialmente equilibrada e lavada com tampão Tris-HCl a pH 7.2 contendo CaCl2 e MgCl2. Após a remoção de todas as moléculas que não apresentavam afinidade para a Con A, as glicoproteínas foram eluídas da coluna com o tampão metil a-D manopiranosido. Após esta primeira fase de purificação, procedeu-se à segunda etapa cromatográfica de purificação, utilizando um coluna de troca iónica (DEAE-Sepharose). A eluição foi realizada em quatro passos, utilizando o tampão Tris-HCl, pH 8 com 0%, 40%, 80% e 100% de NaCl. Desta forma, foram obtidas duas frações distintas, sendo que a segunda apresentava uma elevada actividade específica (144.33 U/mg), um factor de purificação de 28.03 e um rendimento de 26.58 %. A análise por SDS-PAGE confirmou a existência de apenas uma banda proteica com massa molecular aproximada de 40 KDa. Após a purificação procedeu-se à caracterização da protease purificada. Para tal, foi estudado o efeito do pH, temperatura, de inibidores (PMSF, EDTA e EGTA) e de iões metálicos na sua atividade e foram determinados os parâmetros cinéticos (KM a Vmax). Desta forma, verificou-se que a protease apresenta uma atividade ótima a pH 8, e a uma temperatura de 50º C. Já na presença dos inibidores verificou-se que o PMSF inibia a atividade em cerca de 90%, enquanto o ião Mn2+ inibia por completo a atividade da protease, o que permitiu concluir que se tratava de uma serina protease. No cálculo dos parâmetros cinéticos verificou-se que a serina protease apresentava um KM igual a 0.51 mg/ml e um Vmax de 7.38 µmol/min/ml. De uma forma geral, pode concluir-se que os objetivos deste trabalho foram alcançados. Pela primeira vez foi purificada e caracterizada uma serina protease num extrato de A. alternata. Apesar dos resultados apresentados, não se pode concluir que a serina protease purificada é na verdade o alergénio Alt a 15, sendo ainda necessária a realização de teste imunológicos com soro de indivíduos sensibilizados ao Alt a 15. Contudo, este trabalho representa um ponto de partida para um melhor conhecimento dos alergénicos da A. Alternata, podendo contribuir para o avanço no diagnóstico e tratamento das doenças alérgicas provocadas por espécies fúngicas.
