Author(s): Figueiredo, Vanessa Andrade
Date: 2015
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/6000
Origin: uBibliorum
Subject(s): Cromatografia de Afinidade; Isoforma Superenrolada; Monolito de Arginina; Plasmídeo Hpv16 E6/E7mut; Transfeção; Vacinas de Dna; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química
The Human papillomavirus (HPV) infection is one of the most common sexually transmitted virus and is responsible for various human epithelial lesions, including cervical cancer. The initial step for cancer progression consists in immortalization of normal epithelial cells. The carcinogenicity of HPV16 infections is associated with E6 and E7 proteins, which deregulate the host cell cycle by inhibiting tumor suppressor protein (p53) and retinoblastoma protein (pRb), respectively. DNA vaccines induce an immune response which allows the prevention or treatment of infections by viruses, bacteria and parasites. One of the best strategies used for this purpose is the plasmid DNA (pDNA). Our research group has been studying a way to effectively develop the production and purification of sc pDNA vaccine HPV16 E6/E7 through the use of a monolith modified with arginine ligands. However, it is necessary to ensure that these proteins are unable to induce cell immortalization. Thus, the E6 and E7 protein oncogenic potential was removed by introducing point mutations, which inhibit interactions of these proteins with p53 and pRb. Afterwards, affinity chromatography was used to purify sc HPV16 E6/E7MUT pDNA, taking advantage of a purification strategy with arginine monolith, previously explored by our research group for the non-mutated plasmid. A purity degree > 99% and a recovery yield of 82% was achieved, which were comprised within the values obtained in our group. After optimization of the purification strategy, impurities such as genomic DNA (gDNA), RNA, endotoxin and proteins were quantified. A significant decrease in impurities of purified sc pDNA sample was observed when compared to initial lysate sample. Finally, in vitro transfection studies were performed to evaluate the fibroblast cell transfection efficiency and the subsequent expression of the target proteins, encoded by the genes contained in the pDNA vaccine. These results allowed us to conclude that the transfection process was successful, leading to increased E6 and E7 protein expression compared to non-transfected cells.
Com a descoberta do genoma Humano tem sido cada vez mais fácil identificar e estudar diferentes genes implicados em diversas doenças tais como o cancro, doenças cardiovasculares, doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Estas e inúmeras outras doenças, nomeadamente infeciosas, têm sido responsáveis pela morte de milhões de pessoas devido à ausência de um tratamento eficaz e pouco agressivo. Por esta razão, a investigação biomédica tem focado cada vez mais a procura de abordagens terapêuticas alternativas. O desenvolvimento de vacinas de DNA tem como objetivo induzir uma resposta imunitária que permita a prevenção ou tratamento de infeções provocadas por vírus, bactérias e parasitas. Uma das estratégias preferencialmente utilizadas com esta finalidade baseia-se na utilização de DNA plasmídico (pDNA) contendo genes que codificam um antigénio. Posto isto, torna-se necessário criar estratégias eficientes de purificação para obter o pDNA puro de maneira a poder ser aplicado terapeuticamente. Assim, a cromatografia de afinidade tem sido cada vez mais aplicada como estratégia de purificação, devido à elevada seletividade obtida pela isoforma superenrolada (sc) do pDNA, permitindo não só isolar esta isoforma de outras menos eficazes biologicamente (circular aberta, linear), mas também eliminar impurezas que poderão ser tóxicas para os seres humanos. Os suportes monolíticos surgiram como uma ótima adjuvante na purificação de pDNA, juntamente com os ligandos de afinidade, pois permitem uma separação mais rápida e eficiente, assim como elevadas capacidades de ligação. O vírus do papiloma humano (HPV) é um dos vírus sexualmente transmissíveis mais comuns que causam várias lesões epiteliais, que podem conduzir ao desenvolvimento de cancro do colo útero. Existem diferentes tipos de HPV que estão associados a diferentes tipos de riscos, mas cerca de 70% dos casos de cancro cervical são atribuídos ao HPV16 e 18 de alto risco. O passo inicial da progressão do cancro é a imortalização de células epiteliais normais. A carcinogenicidade das infeções causadas pelo HPV16 estão associadas às proteínas E6 e E7 do vírus, que atuam na desregulação do ciclo celular através da inibição das proteínas supressoras de tumores como a p53 e a proteína retinoblastoma (pRb), respetivamente. O nosso grupo de investigação implementou a produção e purificação da vacina de pDNA sc HPV16 E6/E7, através da utilização de um monolito modificado com ligandos de arginina. Para garantir que os antigénios E6 e E7 não irão ser responsáveis pela imortalização das células transfetadas, no presente trabalho bloqueou-se o potencial oncogénico das proteínas E6 e E7 através da introdução de mutações pontuais, que à partida irão inibir as interações destas proteínas com a p53 e a pRb. A modificação do plasmídeo deu origem ao pDNA HPV16 E6/E7MUT, sendo crucial a sua produção, extração e purificação para posterior aplicação terapêutica. Assim, recorreu-se à estratégia biotecnológica implementada anteriormente pelo grupo de investigação, para o plasmídeo não mutado, tirando proveito da cromatografia de afinidade, utilizando o monolito modificado com ligandos de arginina. Posto isto, verificou-se que as condições de produção e purificação para o pDNA HPV16 E6/E7MUT não mudaram significativamente em relação à estratégia já utilizada anteriormente. Foi obtida uma pureza de 100% e uma recuperação de 82%, encontrando-se dentro dos valores obtidos anteriormente para o outro plasmídeo. Após a otimização da estratégia de purificação, foram quantificadas as impurezas, DNA genómico (gDNA), RNA, endotoxinas e proteínas, verificando-se uma diminuição significativa do teor de impurezas da amostra inicial de lisado para a amostra purificada de pDNA sc. Todos os valores de impurezas se encontram dentro dos limites recomendados pelas agências reguladoras como a FDA. Por fim, foram realizados estudos de transfeção in vitro com fibroblastos de modo a avaliar a eficiência de transfeção celular e a expressão das proteínas codificadas pelos genes mutados contidos na vacina de pDNA. De modo a que estes parâmetros fossem avaliados, recorreu-se à utilização das técnicas de, transcrição reversa, seguida de reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-qPCR) e Western blot. Com isto, foi possível verificar que o processo de transfeção ocorreu com sucesso, observando-se um aumento do RNA mensageiro E6 e E7 que posteriormente se traduz num aumento da expressão das proteínas E6 e E7 em comparação com as células não transfetadas.
