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Spatiotemporal study of morpho-functional modifications on cell nucleus during African swine fever virus infection

Author(s): Simões, Margarida Pires

Date: 2015

Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.5/9844

Origin: Repositório da UTL

Project/scholarship: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/3599-PPCDT/105630/PT ; info:eu-repo/grantAgreement/EC/FP7/311931/EU;

Subject(s): ASFV; Virus-host interactions; Nucleus; ATR pathway; Intranuclear viral genome replication; Subnuclear domains; PML; Epigenetic signatures; Heterochromatin; VPSA; Interacções vírus-núcleo; Núcleo; Via ATR; Replicação viral intranuclear; Subdomínios nucleares; PML; Assinaturas epigenéticas; Heterocromatina


Description

Studies on virus-host interactions are decisive to enhance our understanding on how African swine fever virus (ASFV) subverts cellular mechanisms, and also to better characterize host nucleus changes enabling this infection. Immunofluorescence studies and immunoblotting analysis of ASFV-infected cells, allowed us to identify the Ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related (ATR) pathway as the specific DNA damage response (DDR) mechanism activated by ASFV infection. Additionally, the use of ATR kinase-dead cells confirmed that ATR has an essential role for the infection success. The viral intranuclear replication was then pursued using BrdU-pulse experiments, supported on previous reports about ASFV genome presence inside the host nucleus and the proven ATR activation. BrdU-labelled DNA molecules confirmed the active viral replication at early infection times, exclusively within the cell nucleus. Related spatial and morphological nuclear changes during ASFV infection were further addressed, particularly on subnuclear domains and host chromatin epigenetic signatures. Promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML-NBs), nuclear speckles and Cajal bodies displayed major alterations, accompanied by a repressive nuclear environment. PML knockdown revealed an essential proviral activity for ASFV successful infection. Herein, suggestions on how this work may help in the development of therapeutic strategies against ASFV infections can be found.

ABSTRACT - Estudo espacio-temporal das alterações morfo-funcionais do núcleo celular durante a infeção pelo vírus da peste suína africana - Estudar as interacções vírus-núcleo da célula hospedeira é fundamental para melhor compreendermos a subversão dos mecanismos nucleares pelo Vírus da peste suína africana (VPSA), e como estas facilitam a infecção. Ensaios de imunofluorescência e expressão proteica (imunodetecção) permitiram a identificação da via ATR (Ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related) como mecanismo de reparação de ADN especificamente activado pelo VPSA. Seguidamente, através de células modificadas na expressão de ATR, confirmou-se o papel essencial do ATR para esta infecção. Atendendo às evidências de presença do vírus no núcleo celular e à activação da via ATR, quisemos desvendar a replicação intranuclear do VPSA pelo meio de ensaios pulso-caça de BrdU. Moléculas de ADN marcadas com BrdU confirmaram a replicação viral, exclusivamente no núcleo, na fase precoce da infecção. Seguiu-se o estudo das alterações espaciais e morfológicas do núcleo induzidas pelo VPSA, particularmente as modificações dos sub-domínios nucleares e das assinaturas epigenéticas da cromatina da célula. Domínios PML (Promyelocytic leukaemia), speckles nucleares e corpos de Cajal mostram-se alterados, associando-se a um ambiente nuclear repressivo. Estudos funcionais da proteína PML revelaram o seu papel proviral desta infecção. Nesta tese apresentam-se ainda sugestões acerca do potencial destes estudos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas no combate anti-viral.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas

Document Type Doctoral thesis
Language English
Advisor(s) Ferreira, Fernando António da Costa; Martins, Carlos Manuel Lopes Vieira
Contributor(s) Simões, Margarida Pires
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