Author(s): Mendes, Cláudia Carolina de Almeida,1986-
Date: 2010
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2029
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Biologia celular; Proteínas quinases; Endocitose; Apoptose; Drosophila; Teses de mestrado
Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
Epithelial integrity generally depends on the balance between the stability and remodelling of adherens junctions (AJs). Growing evidence indicates that endocytosis has a central role in maintaining AJs in a state of dynamic equilibrium. However, it is not currently understood how AJs remodelling is achieved without losing epithelial integrity. In this work, I found that Capping Protein (CP), which prevents extension of the barbed ends of actin filaments, interacts genetically with atypical protein kinase C (aPKC), a major effector of the Par-aPKC complex, to maintain epithelial integrity in Drosophila wing imaginal disc. This genetic interaction appears to have differential requirements along the wing disc, since decreasing CP and aPKC levels induce extrusion and death of wing blade cells, whereas cells in the distal hinge region seem to overproliferate. Interestingly, loss of CP results in a significant reduction of aPKC from the apical membrane, suggesting that CP may restrict apical localization of aPKC, which in turn, is required to control AJs dynamics. In addition, similar to apkc mutant tissues, loss of CP leads to decreased apical levels of the AJs components, E-Cadherin (E-Cad) and Armadillo (Arm), suggesting that both CP and aPKC promote AJs stability by regulating early endocytic events. Therefore, by promoting the formation of a highly branched actin network, CP could have a putative role in AJs stability and remodelling by restricting aPKC to the apical membrane and by promoting early endocytic events. Taken together, the presented data highlight the crucial synergy between polarity complexes and actin cytoskeleton in regulating AJs dynamics, which is intimately linked to the maintenance of epithelial integrity.
Os tecidos epiteliais possuem duas propriedades contraditórias: têm uma arquitectura robusta, necessária para a sua estabilidade, porém exibem uma extensa plasticidade de modo a permitir eventos celulares tais como divisão e morte celular [1, 2]. Quando ocorre uma perda na regulação deste balanço entre estabilidade e plasticidade, as células epiteliais perdem a adesão entre elas e adquirem a capacidade de sobreproliferar. De facto, a maioria dos tumores malignos surge apartir de epitélios com defeitos no controlo da adesão e proliferação [3, 4]. A adesão entre células epiteliais é em parte devida à acção coesiva das junções aderentes (AJs), cuja principal função é ligar o citoesqueleto de actina entre células vizinhas. As AJs circundam a região apical das células e são principalmente compostas pela proteína transmembranar E-Caderina (E-Cad). Através do seu domínio citoplasmático, E-Cad associa-se a β-catenina (em Drosophila codificada por armadillo, arm) e α-catenina, que por sua vez, promove a ligação ao citoesqueleto de actina [5]. Apesar de terem um papel crucial na manutenção da integridade epitelial, recentes estudos têm revelado que as AJs são constantemente remodeladas através de endocitose [6-8], processo celular pelo qual moléculas extracelulares ou associadas à membrana são internalizadas para o interior das células [9, 10]. No entanto, ainda não é compreendido como é que a remodelação das AJs é estabelecida sem que a integridade do epitélio seja perdida. Na região apical às AJs existem dois complexos proteicos que interactuam entre si de modo a promover a polaridade dos tecidos epiteliais: o complexo composto por Crumbs (Crb), Stardust and Discs lost, denominado por complexo Crb, e o complexo constituído por Bazooka/Par3, proteína cinase C atípica (aPKC) e Par6, designado por complexo Par-aPKC [11]. O complexo Par-aPKC é activado através da associação entre Par6 e a Rho-like GTPase Cdc42. Após esta activação, aPKC fosforila Crb, que por sua vez, promove a estabilização das Ajs [12, 13]. Curiosamente, foi demonstrado que a remoção de cdc42 ou apkc em tecidos epiteliais de Drosophila, resulta na acumulação de proteínas apicais associadas à membrana, tais como Crb, em vesículas endocíticas e à redução dos níveis apicais de E-Cad e Arm. Análises genéticas adicionais sugerem que aPKC actua como efector de Cdc42, regulando a endocitose de proteínas apicais, que por sua vez, tem um efeito estabilizador nas AJs durante processos dinâmicos de reorganização celular [14, 15]. Nos tecidos epiteliais, a região apical das células contém uma banda de filamentos de actina, essencial para o suporte das Ajs [2]. O citoesqueleto de actina desempenha um papel fundamental em numerosos processos celulares, tais como regulação da morfologia celular e manutenção da polaridade celular [16]. Dada a sua dinâmica, é necessária uma regulação eficaz, que é desempenhada por proteínas que se ligam à actina (ABPs) [17, 18]. Uma dessas proteínas é o heterodímero Capping Protein (CP), composto pelas subunidades α (Cpa) e β (Cpb), que se ligam à região terminal dos filamentos de actina, prevenindo a perda ou adição de monómeros de actina e, desta forma, a sua polimerização excessiva [19]. A remoção de CP no disco imaginal da asa de Drosophila leva a diferentes fenótipos celulares que são dependentes da região do disco. Enquanto clones de células mutantes para CP mantêm a polaridade e sobrevivem nas regiões do hinge e notum, células mutantes na wing blade sofrem extrusão basal e morrem por apoptose [20]. Semelhante ao fenótipo observado em epitélios mutantes para apkc, diminuição dos níveis proteicos de CP usando a técnica ARN de interferência (RNAi), resulta na acumulação de Crb em estruturas vesiculares [21]. Isto sugere que, tal como aPKC, CP parece regular a endocitose de proteínas apicais. Curiosamente, foi postulado que CP interactua geneticamente com aPKC no disco imaginal da asa [21]. No entado, a ferramenta genética usada para diminuir a activade de aPKC pode ter efeitos inespecíficos [22] e portanto, a possível interacção genética entre CP e aPKC foi novamente analisada. Desta forma, o presente trabalho tinha como objectivo compreender o mecanismo pelo qual CP pode cooperar com aPKC na manutenção da integridade epitelial do disco imaginal da asa de Drosophila. De modo atingir este objectivo, a técnica RNAi sob o controlo do sistema UAS-Gal4, foi usada para diminuir os níveis proteicos de CP em regiões específicas do tecido (García Fernández, B. and Janody, F. et al., unpublished data), e um alelo mutante termosensível para aPKC (apkcts) foi usado para modular a actividade cinásica de aPKC consoante a temperatura (Martinho, R. et al., unpublished data). Quando comparado com o fenótipo anteriormente descrito para células com níveis reduzidos de CP, ao diminuir ambos os níveis de CP e aPKC no disco de asa, uma maior quantidade de células sofreram extrusão basal e morreram por apoptose. Pelo contrário, células mutantes para apkcts encontraram-se mantidas no epitélio, sem nenhum indício de morte celular. Estes resultados confirmam que CP interactua geneticamente com aPKC na manutenção da integridade epitelial do disco da asa. Esta interacção genética parece ter diferentes requerimentos ao longo do disco da asa. Enquanto que a diminuição dos níveis de CP e aPKC levou à morte das células da wing blade, as células na região distal do hinge pareceram proliferar. Isto sugere que CP e aPKC mantêm a integridade epitelial e previnem a morte celular na wing blade, ao passo que na região do hinge, CP e aPKC parecem restringir o crescimento, possivelmente através da regulação da sinalização Hippo [23]. Curiosamente, a diminuição dos níveis de CP resultou numa redução significativa dos níveis apicais de aPKC, sugerindo que, através da sua função como regulador da dinâmica do citoesqueleto de actina, CP restringe a localização de aPKC na membrana apical das células epiteliais. Além disso, semelhante ao fenótipo observado em epitélios mutantes para apkc, diminuição dos níveis de CP levou a um decréscimo acentuado dos níveis apicais de E-Cad e Arm. Isto sugere que CP tem um papel putativo na dinâmica das AJs. Por último, o efeito nos níveis apicais de E-Cad após diminuição dos níveis de CP foi semelhante ao observado após sobreexpressão de Src64B, um importante regulador da estabilidade das AJs. Uma vez que a actividade de Src parece ser regulada por CP (García Fernández, B. and Janody, F. et al., unpublished data), este resultado sugere que o efeito de CP nas AJs pode ser dependente da actividade de Src. Baseando nestas observações, são apresentadas no presente trabalho diferentes hipóteses que pretendem explicar o papel de CP na manutenção da estabilidade das AJs, e de como esta função putativa de CP pode estar interligada com a função conhecida de aPKC na regulação da dinâmica das AJs. VII É importante referir que as diferentes hipóteses não são mutuamente exclusivas e por isso, de um modo geral, através da sua principal função, prevenir a polimerização dos filamentos de actina, CP parece ter um papel putativo na manutenção da estabilidade das AJs por: (a) restringir a localização de aPKC na membrana apical; (b) regular eventos iniciais de endocitose; e (c) regular a actividade de Src. No conjunto, os dados apresentados neste trabalho apontam para uma crucial sinergia entre complexos de polaridade e o citoesqueleto de actina na regulação da dinâmica das AJs, o qual está intimamente ligado à manutenção da integridade dos tecidos epiteliais.
