Biochemical and structural studies on the PhoR-PhoB two-component regulatory system from Deinococcus radiodurans

• Author(s): Caria, Sofia
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2241
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Microbiologia; Teses de doutoramento - 2010
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Enguita, Francisco; Duarte, Aida, 1948-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010.

This thesis concerns studies of a two-component system (TCS) from Deinococcus radiodurans bacterium. TCSs work based on the activity of two proteins: the histidine kinase and the response regulator. Histidine kinases are responsible for several reactions of this mechanism: autophosphorylation, phosphotransfer and phosphatase activity. The mechanism is initiated by an autophosphorylation, induced by a signal from the environment. These proteins are composed of two domains: the dimerisation and histidine phosphorylation domain (DHpD), and the catalytic ATPase domain (CAD). The response regulator is activated by the histidine kinase, through a phosphotransfer reaction. The response regulators are composed by a receiver domain (RD) that will receive the phosphoryl group from the histidine kinase on the aspartate residue, and an effector domain which commonly consists of a DNA-binding domain (DBD). Upon phosphorylation of the RD of the response regulator the protein suffers a conformation change that increases its binding affinity to specific DNA region. The work focuses on the PhoR-PhoB system, a signalling mechanism that gets activated upon environmental phosphate starvation. The activation of PhoB response regulator, through phosphotransfer from PhoR histidine kinase, leads to activation of the last protein with consequent binding to a specific DNA sequence (Pho box), regulating the Pho regulon. The Pho system has been studied in different bacteria using different kinds of approaches. However, the knowledge of this system in D. radiodurans concerns the annotation of the genes that encode the two proteins of the mechanism: PhoR (DR2244) and PhoB (DR2245). This thesis presents the structural characterisation of both full-length proteins and their domains, through small angle X-ray solution scattering (SAXS) analysis. Biochemical data and the X-ray structure of the PhoRCAD domain (resolution 2.25 Å) complement those studies. The biochemical data demonstrates the PhoR autophosphorylation activity as well as phosphoryl transfer activity to PhoBRD.

Esta dissertação refere-se ao estudo estrutural e bioquímico de um dos sistemas de dois componentes (TCS) de Deinococcus radiodurans. O TCSs baseia-se na actividade de duas proteinas: a quinase de histidina e o regulador de resposta. As quinases de histidinas efectuam diversas reacções destes sistemas como autofosforilação, transferência de fosfato e actividade de fosfatase. O mecanismo é iniciado pela autofosforilação da proteína, sendo esta reacção induzida por um sinal ambiental específico. Estas proteínas são compostas dois domínios: o domínio de dimerização e fosforilação de histidina (DHpD) e o domínio catalítico de ATPase (CAD). O regulador de resposta é activado através de uma reacção de fosfotransferência da quinase de histidina; sendo a proteína composta por domínio receptor (RD), que é fosforilado pela quinase de histidina, no aspartato; e pelo domínio effector que neste e na maioria dos casos consiste num domínio de ligação ao DNA (DBD). Após a fosforilação do regulador de resposta, a proteína sofre uma alteração conformacional, dimerizando e aumentando subsequente a sua afinidade de ligação a uma região específica do DNA. O estudo centra-se no TCS PhoR-PhoB, que é activado após uma limitação da concentração de fosfato no meio. A proteína PhoR activa a proteína PhoB através da tranferência do grupo fosfato com consequente aumento da afinidade de última proteína para uma região específica do DNA (Pho box), regulando a transcrição dos genes do regulão Pho. O sistema Pho tem sido alvo de numerosos estudos em diversas bactérias. No entanto, a informação relativa ao sistema em D. radiodurans resume-se apenas à anotação dos genes codificantes para proteínas PhoR (DR2244) e PhoB (DR2245). Nesta tese, é apresentada a caracterização estrutural das proteínas em solução na sua forma integral bem como dos respectivos domínios; utilizando a técnica de difracção de raios-X de pequenos ângulos (SAXS). O estudo é complementado com análises bioquímicas e determinação de estrutura cristalografica do domínio PhoRCAD (resolução de 2.25 Å). Os resultados bioquímicos demonstram a autofosforilação in vitro da proteína PhoR, bem como a sua capacidade para transferir o grupo fosfato para o domínio PhoBRD.

European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)