Molecular epidemiology and evolution of HIV-1 in Portugal and portuguese speaking african countries

• Author(s): Bártolo, Inês Isabel Fernandes, 1975-
• Date: 2011
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/4456
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Teses de doutoramento - 2011
• Document Type: Doctoral thesis
• Language: English
• Advisor(s): Taveira, Nuno, 1964-; Silva, Patrícia Maria Cavaco, 1966-; Pereira, José Moniz, 1949-
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011

The aims of this thesis were to better characterize HIV-1 diversity in Portugal, Angola, Mozambique and Cape Verde and to investigate the origin and epidemiological history of HIV-1 in these countries. The impact of these issues in diagnosis, disease progression and susceptibility to ARV therapy was also investigated. Finally, the nature, dynamics and prevalence of transmitted drug resistance (TDR) was determined in untreated HIV-1 infected patients. In Angola, practically all HIV-1 genetic forms were found, including almost all subtypes, untypable (U) strains, CRFs and URFs. Recombinants (first and second generation) were present in 47.1% of the patients. HIV/AIDS epidemic in Angola probably started in 1961, the major cause being the independence war, subsequently spreading to Portugal. In Maputo, 81% of the patients were infected with subtype C viruses. Subtype G, U and recombinants such as CRF37_cpx, were also present. The results suggest that HIV-1 epidemic in Mozambique is evolving rapidly in genetic complexity. In Cape Verde, where HIV-1 and HIV-2 co-circulate, subtype G is the prevailed subtype. Subtypes B, C, F1, U, CRF02_AG and other recombinant strains were also found. HIV-2 isolates belonged to group A, some being closely related to the original ROD isolate. In all three countries numerous new polymorphisms were identified in the RT and PR of HIV-1 viruses. Mutations conferring resistance to the NRTIs or NNRTIs were found in isolates from 2 (2%) patients from Angola, 4 (6%) from Mozambique and 3 (12%) from Cape Verde. None of the isolates containing TDR mutations would be fully sensitive to the standard first-line therapeutic regimens used in these countries. Close surveillance in treated and untreated populations will be crucial to prevent further transmission of drug resistant strains and maximize the efficacy of ARV therapy. In Portugal, investigation of a seronegative case infection with rapid progression to AIDS and death revealed that the patient was infected with a CRF14_BG-like R5-tropic strain selectively transmitted by his seropositive sexual partner. The results suggest a massive infection with a highly aggressive CRF14_BG like strain and/or the presence of an unidentified immunological problem that prevented the formation of HIV-1-specific antibodies. Near full-length genomic sequences obtained from three unrelated patients enabled the first molecular and phylogenomic characterization of CRF14_BG from Portugal; all sequences were strongly related with CRF14_BG Spanish isolates. The mean date of origin of CRF14_BG was estimated to be 1992. We propose that CRF14_BG emerged in Portugal in the early 1990s, spread to Spain in late 1990s as a consequence of IDUs migration and then to the rest of Europe. Most CRF14_BG strains were predicted to use CXCR4 and were associated with rapid CD4 depletion and disease progression. Finally, we provide evidence suggesting that the X4 tropism of CRF14_BG may have resulted from convergent evolution of the V3 loop possibly driven by an effective escape from neutralizing antibody response.

A infecção VIH/SIDA é um grave problema de saúde pública, particularmente na África subsaariana, onde vivem 67% dos infectados. O diagnóstico, a terapêutica e a prevenção da infecção VIH/SIDA dependem do conhecimento aprofundado da sua epidemiologia bem como dos agentes causadores desta infecção. A diversidade genética de VIH-1 pode ter impacto a vários níveis, nomeadamente, no diagnóstico, transmissão, progressão da doença e emergência de resistências aos fármacos antirretrovirais (revisto no Capítulo 1). Com a recente introdução da terapêutica antirretroviral combinada (TARc) nos países em vias de desenvolvimento, o prognóstico dos doentes que têm acesso a estes fármacos melhorou substancialmente, com uma marcada diminuição das taxas de mortalidade e morbilidade. No entanto, há preocupações relativas à baixa eficácia da TARc nestes países, o que pode levar à rápida e descontrolada emergência de variantes resistentes aos fármacos antirretrovirais e à sua subsequente transmissão. Há vários aspectos que podem levar à baixa eficácia da TARc, nomeadamente a monitorização limitada da carga viral nos doentes em terapêutica, o uso não regulado de fármacos antirretrovirais comprados no mercado negro e a falta de sistemas de vigilância de resistências. Os estudos de epidemiologia molecular e de resistência aos fármacos antirretrovirais na infecção VIH-1 descritos nesta dissertação foram realizados em Angola, Moçambique, Cabo Verde e Portugal. Estes países têm fortes laços históricos, sociais, culturais e económicos. Contudo, a infecção VIH/SIDA afecta estes países de forma muito diferente. Moçambique é um dos países da África subsaariana com maior taxa de prevalência da infecção VIH-1 (11,5%), tendo províncias com prevalências superiores a 25%. Angola tem uma prevalência moderada de 6,5%, sendo Luanda a província que apresenta a prevalência mais elevada do país (13,6%). Cabo Verde apresenta uma taxa de prevalência muito baixa para um país Africano, inferior a 1%. Em Portugal a prevalência da infecção VIH/SIDA sendo baixa (0,6%) é, no entanto, uma das mais elevadas da Europa Ocidental. Em Angola, Moçambique e Cabo Verde, tal como na maioria dos países Africanos, a transmissão da infecção faz-se sobretudo por via heterossexual enquanto em Portugal os toxicodependentes por via endovenosa correspondem a cerca de 40% dos casos de infecção. Em Portugal, os subtipos B e G e a forma recombinante CRF14_BG dominam a epidemia de infecção por VIH-1 mas pouco se sabe sobre a sua origem e história epidemiológica. Relativamente a Angola, Moçambique e Cabo Verde, há pouca ou nenhuma informação sobre os subtipos virais, sobre a sua origem e história epidemiológica e sobre o seu potencial impacto no diagnóstico, progressão da doença e susceptibilidade e resistência aos fármacos antirretrovirais. Pouco se sabe também sobre a natureza e a prevalência das mutações de resistência (primárias e secundárias). Deste modo, os objectivos desta dissertação foram: 1) caracterizar a diversidade genética de VIH-1 em Portugal, Angola, Moçambique e Cabo Verde, e investigar a origem e história epidemiológica deste vírus nestes países; 2) analisar o impacto da diversidade genética no diagnóstico, progressão para a doença e susceptibilidade à terapêutica antirretroviral; e 3) determinar a prevalência das resistências transmitidas em doentes não tratados dos três países Africanos. Foram colhidas amostras de plasma de doentes VIH-1 tratados e não tratados, entre 1993 e 2007, de Angola, Moçambique e Cabo Verde (Capítulos 2-5). Para subtipagem e/ou análise de mutações de resistência, foram obtidas sequências dos genes gag (p17), pol (PR and RT) e/ou env (C2C3) utilizando para amplificação um protocolo de PCR desenvolvido no nosso laboratório. Os genótipos virais foram determinados por análise filogenética. As mutações de resistência foram determinadas recorrendo ao Stanford Genotypic Resistance Interpretation Algorithm. As mutações associadas com resistência transmitida foram seleccionadas de listas publicadas recentemente. Para definir se uma mutação era um polimorfismo natural de um determinado subtipo, as frequências de todos os polimorfismos encontrados nas sequências de doentes tratados e não tratados, foram comparadas com sequências de todo o mundo do mesmo subtipo e/ou de subtipo B. Nos doentes não tratados infectados com vírus resistentes, o perfil mutacional foi analisado para se poder indicar o regime antirretroviral de 1ª linha mais efectivo. Nos doentes tratados, sempre que possível correlacionou-se a presença de mutações de resistência com parâmetros imunológicos e virológicos e com o regime antirretroviral em uso. Usaram-se métodos filogenéticos para determinar a origem dos vírus resistentes e para determinar se os doentes eram epidemiologicamente relacionados. Na investigação de um caso de infecção VIH-1 seronegativa fez-se uma caracterização inicial de vírus recombinantes CRF14_BG com base em sequências clonais parciais dos genes gag e env (Capítulo 6). Para a caracterização completa destes CRF14_BGs Portugueses, obtiveram-se sequências genómicas completas a partir de amostras de três doentes, um jovem adulto com infecção seronegativa infectado por via heterossexual e duas crianças infectadas por via vertical, em 1997 (Capítulo 7). A reconstrução da história evolutiva desta CRF foi realizada através de molecular clock analysis. Métodos genéticos e filogenéticos foram usados para determinar o tropismo de um número significativo de isolados CRF14_BG de doentes Portugueses e investigar a selecção positiva na região V3. Em Angola encontraram-se praticamente todas as formas genéticas de VIH-1 do grupo M excepto o subtipo B (Capítulo 2). Quarenta e sete por cento dos doentes estava infectado com vírus recombinantes, dos quais 36% eram de 2ª geração. Encontraram-se 58 perfis de recombinação diferentes. Encontraram-se ainda numerosos isolados não tipáveis e dois novos grupos de sequências dentro da radiação do subtipo A que podem constituir novos sub-subtipos A. Os dados epidemiológicos disponíveis e a elevada divergência genética intra-subtipo dos isolados Angolanos são consistentes com uma epidemia antiga neste país. Pensamos que a guerra colonial com os Portugueses (1961-1974) terá sido a principal causa da disseminação de VIH-1 em Angola. A epidemia de VIH/SIDA em Portugal (Capítulo 7) e Cabo Verde (Capítulo 5) é causada por uma grande proporção de subtipos não-B e recombinantes, alguns fortemente relacionados com os isolados Angolanos. Deste modo, a grande migração de pessoas durante a guerra colonial com Angola pode também ter promovido a disseminação de subtipos não-B de VIH-1 para Portugal e Cabo Verde, possivelmente em meados dos anos 60, e daí para o resto do mundo. Tendo isto em conta, é provável que Angola tenha sido um dos epicentros da actual epidemia de subtipos não-B em todo o mundo. Em Maputo, Moçambique, a maior parte (81%) dos doentes estava infectada com vírus de subtipo C de origem diversa (Capítulo 4), contudo, também se detectaram quase todos os outros subtipos. De relevância particular neste contexto, foi a identificação de um cluster de isolados CRF37_cpx que terão sido importados recentemente para Moçambique. Em geral, os nossos resultados indicam que a epidemia VIH-1 em Moçambique (Maputo) está a evoluir rapidamente em complexidade genética devido à recente introdução de todos os principais subtipos e formas recombinantes. No futuro será importante determinar de que modo esta alteração da diversidade viral terá impacto na epidemia de VIH/SIDA em Moçambique. Em Cabo Verde caracterizou-se pela primeira vez as formas genéticas de VIH-1 e de VIH-2 em circulação (Capítulo 5). O subtipo G de VIH-1 foi o subtipo mais prevalente (48%). Encontraram-se ainda outros subtipos bem como variantes não tipáveis, sozinhos ou em formas recombinantes. Os isolados de subtipo G de Cabo Verde são extremamente divergentes em relação aos isolados de referência e na sua maioria parecem ter origem em Portugal e/ou Angola. Isto não é surpreendente visto Cabo Verde ter fortes relações históricas, sociais e económicas com estes dois países. Encontrou-se um recombinante C(pol)/G(env) ainda não descrito que importa agora sequenciar a nível genómico para determinar se poderá vir a definir uma nova CRF_CG. Todos os isolados VIH-2 pertenciam ao grupo A, um grupo que é também endémico em Portugal e nos países da África Ocidental relacionados com Cabo Verde. Encontraram-se dois isolados VIH-2 que partilhavam um ancestral comum com o histórico VIH-2ROD, o primeiro VIH-2 a ser sequenciado em 1987. Estes resultados sugerem que a origem do VIH-2 ROD é Cabo Verde e que este país poderá ser ter sido um dos epicentros da actual epidemia de VIH-2. Não se encontraram mutações de resistência major aos inibidores da protease (IPs) na PR dos isolados de VIH-1 presentes em Angola, Moçambique e Cabo Verde (Capítulos 3, 4, 5), o que é consistente com o facto dos regimes de primeira linha utilizados nestes países não inclurem esta classe de fármacos. No entanto, na PR dos isolados não-B foram identificados um grande número de polimorfismos naturais em posições que no subtipo B são consideradas mutações minor de resistência aos IPs (exs. L10I/V, V11I e T74P). Adicionalmente, foram encontrados novos polimorfismos ainda não descritos nas bases de dados de sequências de PR referentes a doentes não tratados. Estes resultados confirmam que os vírus que circulam nestes países são extremamente divergentes e sugerem que estes vírus poderão ter uma barreira genética de resistência diminuída para alguns IPs. Na RT dos isolados VIH-1 de Angola, Moçambique e Cabo Verde também se encontraram numerosos polimorfismos que poderão ter impacto na susceptibilidade aos inibidores da RT (Capítulos 3, 4, 5). Adicionalmente, foram encontradas mutações de resistência aos INRTs (M41L, D67N, M184V, L210W, T215F/Y, K219Q) e INNRTs (K103N) nalguns doentes não tratados de Angola (2 doentes, 2%), Moçambique (4, 6%) e Cabo Verde (3, 12%). Nenhum destes isolados com mutações de resistência foi totalmente sensível aos regimes antirretrovirais de primeira linha usados nestes países. A baixa prevalência de resistência transmitida encontrada em Angola é consistente com a baixa disponibilidade de antirretrovirais no período de estudo (1993-2001). Pelo contrário, as taxas de resistência transmitida encontradas em Moçambique e Cabo Verde foram inesperadas dado que os fármacos antirretrovirais só começaram a estar disponíveis nestes países por volta de 2004. Os nossos resultados sugerem que a maior parte dos isolados resistentes terão sido importados de países onde a terapêutica está disponível há mais tempo. No entanto, o uso não monitorizado de antiretrovirais poderá também ser responsável por estas taxas relativamente elevadas de transmissão de vírus resistentes. Em Portugal estudámos um caso raro de infecção seronegativa por VIH-1 com rápida progressão para SIDA e morte (Capítulo 6). O doente estava infectado com um vírus recombinante B(env)/G(gag) semelhante à CRF14_BG encontrada originalmente em Espanha em toxicodependentes. A análise filogenética indicou que o doente tinha sido infectado pela sua parceira sexual, uma toxicodependente, e que havia uma evolução genética muito restrita do vírus. A análise genética do tropismo indicou que o doente foi infectado selectivamente com uma variante CCR5. Estes dados demonstraram que na ausência de pressão selectiva por anticorpos os vírus CCR5 podem provocar SIDA e morte. No global, os resultados sugeriram uma infecção massiva com uma estirpe tipo CRF14_BG extremamente agressiva e/ou a presença de um problema imunológico não identificado no doente que impediu a formação de anticorpos específicos contra VIH-1. Por sequenciação e análise filogenética do genoma completo de três doentes não relacionados, infectados com recombinantes B/G, fizemos a primeira caracterização molecular e evolutiva dos vírus CRF14_BG em circulação em Portugal (Capítulo 7). Os nossos resultados sugerem que a CRF14_BG terá emergido em Portugal em 1992 (1989-1996) após o início da epidemia, tendo-se disseminado para Espanha no fim dos anos 90, provavelmente como consequência da migração de toxicodependentes, e depois para o resto da Europa. Verificámos que a grande maioria dos isolados CRF14_BG usa o co-receptor CXCR4 e estão associados à rápida depleção das células CD4 e progressão para SIDA. Finalmente, verificámos que só um aminoácido na V3 loop dos CRF14_BG está sobre pressão selectiva enquanto que no subtipo B há quatro aminoácidos sobre pressão selectiva. No conjunto, os resultados sugerem que os vírus CRF14_BG são particularmente patogénicos, que esta característica está em geral associada ao uso do co-receptor CXCR4, e que o uso preferencial deste co-receptor pode resultar de uma evolução convergente determinada pela fuga eficiente à resposta humoral neutralizante.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT,(SFRH/BD/30343/2006); Fundação GlaxoSmithKline das Ciências da Saúde; Fundação Calouste Gulbenkian