Oxidative stress and cell cycle during cork oak somatic embryogenesis

• Author(s): Sousa, Raquel Teixeira de
• Date: 2009
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10773/839
• Origin: RIA - Repositório Institucional da Universidade de Aveiro
• Subject(s): Toxicologia; Embriologia vegetal; Embriogénese; Sobreiros
• Document Type: Master thesis
• Language: English

Description

A embriogénese somática (ES) é uma técnica de propagação in vitro muito utilizada para a regeneração de plantas. A ES apresenta algumas vantagens relativamente a outras técnicas de micropropagação e tem sido bastante reconhecida em programas de melhoramento. O sobreiro (Quercus suber L.) é uma espécie lenhosa com um grande valor económico em Portugal, tendo já sido alvo de estudos de indução de ES. Contudo, algumas fases da ES necessitam ainda de ser optimizadas, e por outro lado, desconhece-se o que medeia a transição de tecido não-embriogénico (TNE) para tecido embriogénico (TE). Pretende-se estudar a) o stress oxidativo e b) a dinâmica do ciclo celular durante a indução de ES de sobreiro, comparando TNE vs. TE. Para indução de TE e TNE, embriões somáticos dicotiledonares maturos foram isolados e colocados em meio de cultura MS com 1,0 mg l-1 2,4-ácido diclorofenoxiacético e 2,0 mg l-1 Zeatina. Para avaliar o nível de stress oxidativo na indução de ES, procedeu-se ao estudo de enzimas antioxidantes, como catalase (CAT), dismutase do superóxido (SOD) e peroxidase do guaiacol (G-POX) assim como de outros parâmetros de monitorização de stress oxidativo (peróxido de hidrogénio, prolina, malonildialdeído). Para avaliar o efeito dos tratamentos (meio de indução ou expressão) ao nível do ciclo celular recorreu-se à técnica de citometria de fluxo (FCM). Além das diferenças morfológicas, verificou-se que a actividade das enzimas antioxidantes diferem entre ambos os tecidos, sendo estatisticamente diferentes apenas para SOD. SOD e G-POX apresentaram tendência para valores mais elevados no TNE, enquanto CAT mostrou maior actividade no TE relativamente ao TNE. Apesar de não ter revelado diferenças significativas, TE mostrou maior tendência para níveis mais elevados de malonildialdeído e prolina. Da análise do ciclo celular verificou-se que a maioria dos núcleos se encontrou na fase G0/G1 independentemente do tecido e do tratamento. Não foram observadas diferenças significativas entre as fases S e G2. Este é o primeiro estudo que contempla a monitorização do stress oxidativo e do ciclo celular durante a indução de ES em sobreiro. Em conclusão, a partir dos dados apresentados neste estudo, existem algumas suspeitas quanto a possíveis diferenças entre TE e TNE durante a indução de ES em sobreiro relativamente ao stress oxidativo e ciclo celular, mas que necessitam de ser confirmadas, por exemplo aumentando o número de amostras para cada ensaio. Desta forma, é necessário proceder a mais estudos de modo a conhecer melhor o possíveis papeis do stress oxidativo durante a ES (causa/efeito), aprofundando o conhecimento deste processo para aplicação da produção de plantas em larga escala. ABSTRACT: Somatic embryogenesis (SE) is a technique for in vitro propagation which is used for regeneration of whole plant. The SE has some advantages over other techniques of micropropagation and has been recognized in breeding programs. Cork oak (Quercus suber L.) is a woody species with a great economic value in Portugal and has also been the subject of several studies in SE induction. However, some SE stages still require optimization and, on the other hand, factors that might mediate the transition from non-embryogenic tissue (NEC) to embryogenic tissue (EC) are still unknown. It was evaluated a) the oxidative stress status and b) cell cycle dynamics during cork oak SE induction, comparing NEC vs. EC. For the induction of EC and NEC, mature dicotyledonary embryos were isolated and placed onto a MS culture medium supplemented with 1.0 mg l-1 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid and 2.0 mg l-1 Zeatin. To access the level of oxidative stress in SE induction, it was proceeded the study of antioxidant enzymes such as catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and guaiacolperoxidase (G-POX) as well as other parameters for oxidative stress monitoring (hydrogen peroxide, proline, malonyldialdeyde). To evaluate the effects of treatments (induction or expression medium) on cell cycle, flow cytometry (FCM) was performed. Besides the morphological differences, it was found that the activity of antioxidant enzymes differ in both tissues, being statistically different only for SOD. SOD and G-POX showed a bias to higher values in NEC, while CAT revealed greater activity in EC than NEC. Although no significant differences were detected, EC showed a bias to higher levels of proline and malonyldialdeyde. Analysis of cell cycle highlighted a largest amount of nuclei in G0/G1 phase regardless of the tissue and treatment. No significant differences were observed between S and G2 phases. This is the first study that addresses the monitoring of oxidative stress and cell cycle during cork oak SE induction. In conclusion, from the data presented in this study, there are some clues that may indicate differences between NEC and EC during SE induction in cork oak in relation to oxidative stress and cell cycle. However, this study should be confirmed in e.g. by increasing samples amount in each assay. Moreover, more studies should be fulfilled to unveil the possible roles of oxidative stress during SE (cause/effect), deepening the knowledge of the process to improve plant large-scale production.