Purification of recombinant human membrane COMT by ionic exchange chromatography

• Author(s): Correia, Filipa Inês Feliciano
• Date: 2013
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10400.6/3247
• Origin: uBibliorum
• Subject(s): Q-Sepharase; COMT (Catecol-O-methytransferase)
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Passarinha, Luís António Paulino
• Contributor(s): uBibliorum

Description

Catechol-O-methyltransferase (COMT) is an important target in protein engineering due to their role in normal brain and their possible role in human neurological disorders such as Parkinson's, schizophrenia, depression and Alzheimer's disease. So, the development of new COMT inhibitors led to an improvement of Parkinson disease treatment. However, despite the fact that human SCOMT has been extensively studied, few studies have been published in relation MBCOMT chromatographic recovery and respective bioactivity levels. Therefore, in this work we compare the chromatographic profile of hSCOMT and hMBCOMT using Q-Sepharose as ligand, in order to evaluate activity levels and COMT recovery rates. Results show that both isoforms required different conditions for its adsorption; soluble isoform adsorption is perform at low ionic strength while for MBCOMT it becomes necessary an increasing linear salt gradient. However, the application of 0,5% Triton X-100 in mobile phase promotes hMBCOMT’s adsorption at low ionic strength. Apparently, the use of detergents approaches both isoforms behavior in terms of chromatographic conditions. Specifically, the chromatographic strategies with and without detergents resulted in a 4,3 and 7-fold purification respectively, corresponding to specific activity values of 331 nmol/h/mg and 496 nmol/h/mg. Regarding to specific activity value of hSCOMT, this corresponding to 250 nmol/h/mg and a 3,6-fold purification. Thus, despite the instability of COMT during their handling laboratory, the application of Q-Sepharose as anion exchanger shown to be effective in recovery of both isoforms, it becomes a transversal requirement of chromatographic application for kinetic and pharmacological trials.

A catecol-O-methyltransferase (COMT) é um alvo importante na engenharia das proteínas devido à sua função na actividade normal do cérebro e ao seu possível papel em desordens neurológicas humanas, como a doença de Parkinson’s, esquizofrenia, depressão e Alzheimer’s. Assim, o desenvolvimento de novos inibidores da COMT proporcionou uma melhoria no tratamento da doença de Parkinson’s. No entanto, apesar do facto da SCOMT humana ter sido extensivamente estudada, poucos estudos têm sido publicados relativamente à recuperação cromatográfica da MBCOMT e respectivos níveis de bioactividade. Portanto, neste trabalho foi comparado o perfil cromatográfico da hSCOMT e hMBCOMT usando a QSepharose como ligando, de forma a avaliar os seus níveis de actividade e taxas de recuperação. Os resultados obtidos mostram que ambas as isoformas requerem diferentes condições de adsorção; A adsorção da isoforma solúvel é alcançada com a aplicação de baixa força iónica, enquanto que para a hMBCOMT torna-se necessário um aumento linear do gradiente de sal. Porém, a aplicação de 0,5% de Triton X-100 na fase móvel permitiu a adsorção da hMBCOMT a uma baixa força iónica. Aparentemente, o uso de detergentes aproxima os comportamentos das duas isoformas em termos de condições cromatográficas. Especificamente, as estratégias cromatográficas com e sem detergentes resultaram num índice de purificação respectivamente de 4,3 e 7, o que corresponde a valores de actividade específica de 331nmol/h/mg e 496noml/h/mg. Em relação ao valor de actividade específica da hSCOMT, este corresponde a 250nmol/h/mg e um grau de purificação de 3,6. Assim, apesar da instabilidade da COMT durante o seu manuseamento laboratorial, a aplicação da QSepharose como permutador aniónico revelou ser eficiente na recuperação de ambas as isoformas, tornando-se um requisito transversal de aplicação cromatográfica para estudos cinéticos e farmacológicos.