Autor(es): Pinto, Miguel
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10400.18/975
Origem: Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde
Assunto(s): Genotoxicidade Ambiental; Sediments; Estuary; Genotoxicity; Contaminants; Cytotoxicity
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2011
The Sado Estuary (W Portugal) is affected by various sources of pollution, associated with the existence of an urban center, heavy-industry, mining activities and agriculture. It also remains a privileged site for fishing activities that are responsible for the supplying of consumable resources either locally or externally. Previous studies revealed sizable amounts of contaminants in the estuary sediments, namely metals, pesticides and polycyclic aromatic hydrocarbons. These compounds can be absorbed and accumulated in the edible parts of estuarine species and in local agricultural products, thus entering the human food chain and posing a public health problem. This study aims to assess the cytotoxic and genotoxic effects of sediments from the Sado Estuary in a human cell line, in order to contribute to hazard identification. Sediments were collected in 4 distinct fishing sites (P, E, A, C) of the Sado Estuary; a reference (Mf) and a potentially contaminated sample (M) from a different estuary (Mira Estuary, W Portugal) were also included. Total organic and inorganic contaminants were extracted with a mixture of methanol:dicholomethane and recovered in DMSO. HepG2 cells were exposed for 48h to several concentrations of each extract. Cytotoxicity was measured by the neutral red assay and genotoxicity by the comet assay. A dose-related decrease in cell viability was observed for extracts P, E and M, indicating sediment contaminant-driven cytotoxicity, whereas no significant cytotoxicity was observed for extracts A, C and Mf. A significant increase in the level of DNA damage was observed following cells exposure to extracts P, E, A and M. Also, increased genotoxicity was observed following treatment with the endonuclease FPG, suggesting the induction of oxidative DNA damage. No significant genotoxicity was induced by extracts C and Mf. The differential cytotoxicity and genotoxicity observed in samples from the northern and southern areas of the Sado Estuary probably reflects the pollution from heavy-industrial and urban area vs. intense agricultural area, respectively. Thus, the data suggest the existence of an inherent environmental, ecological and human health, risk associated with the Sado Estuary sediment contamination that must be further assessed.
O Estuário do rio Sado, localizado na costa oeste de Portugal, é maioritariamente classificado como uma reserva natural. Contudo, as suas águas sofrem a influência de diversas fontes de poluição, tais como, poluição urbana e industrial, proveniente da cidade de Setúbal na margem Norte, e poluição associada ao tráfego marítimo, exploração mineira e actividades agrícolas intensivas. Este estuário, pela sua riqueza em espécies aquáticas, é também considerado um local privilegiado para actividades de pesca, efectuadas pelas populações locais, que não só consomem, mas também comercializam o produto da sua pesca. Por outro lado, as águas do estuário também podem ser usadas na agricultura, já que, na margem Sul, existem pequenas hortas e vastas áreas de arrozais. Estudos anteriores revelaram a existência de diversas classes de contaminantes nos sedimentos deste estuário, incluindo metais, pesticidas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, cujos efeitos adversos em organismos vivos são bem conhecidos. Estes compostos podem ser acumulados nas partes edíveis de espécies aquáticas estuarinas, ou em produtos agrícolas, e entrar na cadeia alimentar humana, tornando-se um problema de saúde pública. Este estudo insere-se num projecto mais abrangente que tem como objectivo último a avaliação do risco ambiental, incluindo ecológico e para a saúde humana, associado ao ambiente bentónico estuarino e complementado com a análise de uma população localizada na margem Sul do Estuário do Sado. O presente estudo teve como objectivo específico a avaliação do potencial citotóxico e genotóxico de sedimentos provenientes do Estuário do Sado, através do ensaio do vermelho neutro, e dos ensaios do cometa e do micronúcleo, respectivamente, numa linha celular humana (HepG2). Foram realizadas colheitas de amostras de sedimentos em quatro locais distintos e potencialmente contaminados do Estuário do Sado, dois próximos da margem Norte (P e C) e outros dois junto à margem Sul (E e A). Incluiu-se também, como controlo positivo, uma amostra da margem Norte deste estuário (F), previamente caracterizada pelo elevado nível de contaminação e propriedades genotóxicas em espécies aquáticas. Como área estuarina de referência (não contaminada) seleccionou-se o Estuário do rio Mira (Oeste Portugal), onde foram colhidas: uma amostra de referência (Mf), e uma amostra mais a jusante, junto a uma aquacultura (M). As várias amostras de sedimentos foram sujeitas a uma extracção mecânica com uma mistura de metanol:diclorometano (1:2), permitindo a extracção da grande maioria dos contaminantes orgânicos e inorgânicos, que foram posteriormente recuperados em DMSO, para os ensaios celulares. Avaliou-se a citotoxicidade dos vários extractos em células HepG2 expostas durante 2, 4 e 48h a um intervalo de concentrações entre 0,1 e 20l/ml de meio de cultura, recorrendo-se ao ensaio do vermelho neutro. A caracterização do efeito genotóxico dos vários extractos foi realizada utilizando a versão alcalina do ensaio do cometa na mesma linha celular, e, com vista à quantificação adicional dos danos oxidativos existentes no DNA, em particular purinas oxidadas, recorreu-se também ao mesmo ensaio com tratamento com a enzima FPG. O ensaio do micronúcleo em células com bloqueio da citocinese foi utilizado apenas preliminarmente para estudar os efeitos lesivos ao nível cromossómico dos extracto F, C e M. O período de exposição mais curto, utilizado numa primeira fase para testar as amostras F, C e M, não revelou a existência de um efeito citotóxico marcado, tendo-se optado por utilizar uma exposição mais prolongada de 48h, para todas as amostras em estudo. No que diz respeito ao efeito citotóxico dos extractos de sedimentos do Estuário do Sado, observou-se uma relação dose-resposta para as amostras F, P, e E, e calculouse o IC50 para cada extracto a partir da equação da curva. Em contraste, não foi observada citotoxicidade valorizável para as amostras A e C. Verificou-se que o potencial citotóxico do extracto P, correspondente à amostra colhida junto à margem Norte, é comparável ao da amostra usada como controlo positivo (F), enquanto que os extractos das amostras colhidas junto à margem Sul mostram um menor efeito (E) ou mesmo ausência de efeito (A) na viabilidade celular. Relativamente aos extractos obtidos das amostras do Estuário do Mira, a amostra M produziu efeitos citotóxicos, ao contrário da amostra Mf, que não causou morte celular. Os resultados de citotoxicidade determinaram também o intervalo de concentrações a utilizar para cada extracto nos ensaios de genotoxicidade, de forma a evitar o aparecimento de resultados falsamente positivos. A análise dos efeitos lesivos no DNA, após a exposição de células HepG2 a várias concentrações dos extractos, mostrou que a concentração mais elevada das amostras P e E do estuário do Sado e da amostra M do Mira, causaram uma indução significativa de lesões no DNA, comparativamente ao controlo de solvente. O mesmo se observou para a amostra F, o controlo positivo do Sado. Não obstante, o tratamento com FPG fez aumentar o nível de lesões das amostras P, E, A, e M, e do controlo positivo F, indicando a existência de danos oxidativos adicionais no DNA. Não foi observada genotoxicidade significativa para a amostra C, em qualquer condição testada. Tendo em consideração o nível de lesões de DNA induzido pela concentração mais elevada de cada extracto, as amostras podem ser ordenados por ordem crescente da sua potência genotóxica da seguinte forma: P > F > E > M > Mf > A > C. O mesmo tipo de análise, mas aplicado ao nível de lesões oxidativas induzidas no DNA mostra um ordenamento diferente das amostras: E > A > M > P > F > Mf > C, colocando em evidência a capacidade das amostras E e A de induzirem danos oxidativos. Recorrendo ao ensaio do micronúcleo, apenas para os extractos F, M e C, não foi possível observar um aumento significativo da frequência de micronúcleos, com o aumento da concentração. As diferenças observadas, quer no efeito citotóxico quer genotóxico, entre os extractos preparados a partir das diferentes amostras de sedimentos, poderão ser atribuídas, principalmente, a três tipos de factores: i) factores relacionados com os diferentes tipos de contaminação, antropogénica ou natural, que influenciam cada local de amostragem; ii) diferenças nas pressões hidrodinâmicas de cada local, relacionadas com correntes e marés; iii) diversidade de características granulométricas dos sedimentos que afectam a capacidade de adsorção e retenção de contaminantes. No Estuário do Sado, observou-se uma diferença entre as amostras colhidas numa área de influência industrial e urbana (F e P), e numa área com influência agrícola (A e E). As diferenças detectadas sugerem um tipo ou nível de contaminação diferente, dado que, as amostras F e P têm uma relação mais directa entre a citotoxicidade e a genotoxicidade, e as amostras A e E, embora não sejam particularmente citotóxicas, foram capazes de induzir níveis mais elevados de danos oxidativos no DNA. Este facto, poder-se-á dever à presença de HAPs, PCBs ou metais nas amostras F e P, e à presença de pesticidas e metais nas amostras A e E, sugerido quer pelo tipo de pressões antropogénicas associadas, quer por dados de alguns estudos anteriores em sedimentos deste estuário. Os resultados de cito e genotoxicidade sugerem que a amostra C terá níveis de contaminação muito baixo ou mesmo inexistentes, o que possibilita a utilização desta amostra como referência do Estuário do Sado, para ensaios futuros. Quanto ao Estuário do Mira, observaram-se dois tipos de resposta, quer na citotoxicidade, quer na genotoxicidade, o que parece reflectir dois tipos, ou níveis, de contaminação diferentes. Os resultados obtidos para a amostra M poderão estar associados à existência de resíduos provenientes de uma aquacultura, perto do ponto de amostragem, assim como à presença de metais de origem natural. A amostra Mf não revelou efeitos biológicos valorizáveis, pelo que parece corresponder a uma área não contaminada e, consequentemente, ser uma boa amostra de referência. Em suma, os resultados obtidos reflectem o tipo e nível de contaminação diferencial presente no Estuário do Sado, que advêm de fontes de contaminação e de pressões ambientais diferentes, comparativamente ao obtido no Estuário do Mira. Dada a possibilidade destes contaminantes entrarem na cadeia alimentar humana, através da bioacumulação em espécies aquáticas ou produtos agrícolas, este estudo é imperativo e deverá ser prosseguido, no sentido de estabelecer uma associação entre a contaminação dos sedimentos estuarinos e os possíveis efeitos na saúde humana, demonstrando ser uma temática de saúde pública com importância na biomonitorização ambiental.
