Autor(es): Gomes, Marta Isabel de Carvalho Ferreira
Data: 2013
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/10328
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Células NKT invariantes Foxp3+; Doença alérgica das vias respiratórias; Células T reguladoras; Regulação imunitária; Modelo de ratinho; Teses de mestrado - 2013
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
As células NKT invariantes Foxp3+ demonstram propriedades imunossupressoras após indução da expressão de Foxp3, tendo por isso sido designadas “células NKT reguladoras Foxp3+”. Estas células partilham vários marcadores fenotípicos com as células T reguladoras, tais como a expressão de CD25, GITR e CTLA-4, não perdendo, contudo, as suas características de células iNKT, nomeadamente a expressão de PLZF. Muito embora estas células tenham sido identificadas in vivo em nódulos linfáticos cervicais de ratinhos protegidos de encefalomielite autoimune experimentalmente induzida (EAE), após administração de α-galactosilceramida, o seu estudo tem sido feito recorrendo à conversão in vitro de células iNKT. Assim sendo, para que se verifique a conversão para células que expressem Foxp3, as células iNKT são isoladas por citometria de fluxo e colocadas em cultura com TGF-β, IL-2 e anti-CD28, na presença de anti-CD3 imobilizado em placa de cultura. Apesar do facto das células iNKT Foxp3+ terem já sido caracterizadas, várias características fenotípicas permanecem ainda por estudar. Além disso, a possibilidade de estas células exercerem um impacto semelhante ao apresentado pelas células T reguladoras em algumas patologias nunca foi avaliada. Um bom modelo para testar esse possível impacto é o modelo murino de indução da doença alérgica das vias respiratórias através da administração de ovalbumina (OVA). Neste modelo está descrito que a transferência adoptiva de células T Foxp3+CD25+CD4+ por via sistémica tem a capacidade para suprimir as principais características da doença. Assim sendo, este trabalho tem como objectivos: (1) caracterizar a população de células iNKT Foxp3+ e (2) avaliar se estas exercem um impacto protector in vivo num modelo de ratinho da doença alérgica das vias respiratórias induzida por OVA. Para optimizar o processo de obtenção de células iNKT Foxp3+, células iNKT isoladas de fígado e de baço de ratinhos C57BL/6J foram purificadas por citometria de fluxo e colocadas em cultura com TGF-β, IL-2 e anti-CD28 na presença de anti-CD3 imobilizado em placa durante 4 dias. Após conversão, foi possível demonstrar que não existem diferenças fenotípicas significativas entre células iNKT Foxp3+ de fígado e de baço, dado que ambas as populações expressam de igual forma os marcadores de superfície Nrp-1, CTLA-4, GITR, CD103, PD-1 e NKG2D, não expressando NK1.1 nem CD62L. Foi também demonstrado que células iNKT recentemente saídas do timo apresentam uma maior propensão para conversão em células que expressem Foxp3. Os ensaios efectuados basearam-se num estudo recente que demonstrou que células NKT recentemente saídas do timo apresentam uma expressão característica de neuropilina-1 (Nrp-1), um receptor transmembranar comummente expresso pelas células T reguladoras. Embora tanto as células iNKT Nrp-1+ do fígado como as do baço apresentem maior propensão para conversão que as células Nrp-1-, esta conversão é superior nas células do baço. No que diz respeito aos receptores de quimiocinas, este estudo demonstrou que as células iNKT Foxp3+ expressam CXCR3 e CXCR6, não expressam CCR7 e expressam pouco CXCR5. Este padrão de expressão é semelhante ao já descrito na literatura para as células iNKT, podendo indicar que estas células migram para locais de infecção e inflamação. Vários modelos murinos têm sido descritos como uma excelente ferramenta para estudar a doença alérgica das vias respiratórias, já que estes apresentam um conjunto de características típicas da asma alérgica em seres humanos. Foi demonstrado que estes animais desenvolvem infiltrados inflamatórios nas vias respiratórias, onde se observa em secções de pulmão e em lavados broncoalveolares, eosinófilia e hiperplasia de células calciformes. Estes animais também apresentam um aumento na concentração sérica de IgE e IgG1 específica para alergénio, bem como citocinas Th2 e hiperplasia das células calciformes. Os modelos de imunização activa têm por base a administração de um antigénio, tanto numa pré-imunização, como numa re-exposição por via intra-nasal, de maneira a mimetizar a resposta alérgica a estímulos exógenos. Na fase de re-exposição, o contacto com o alergénio desencadeia uma resposta inflamatória nas viaas respiratórias. O uso de antigénios proteicos como alergénios permite um melhor controlo e reprodutibilidade do modelo, dado que é possível controlar a administração de uma determinada concentração numa determinada localização. No caso particular destes modelos de doença alérgica das vias respiratória, o antigénio mais comummente utilizado é a ovalbumina de ovo de galinha. No entanto, o facto de que mesmo pequenas variações no protocolo, como por exemplo a via de imunização, o adjuvante utilizado, a dose de antigénio administrada, e o background genético dos animais, podem influenciar os resultados do estudo, fazem com que seja crucial uma caracterização prévia do modelo a utilizar. Para analisar o desenrolar das respostas imunes características do protocolo escolhido de indução da doença alérgicas das vias respiratórias através de OVA, ratinhos Thy1.1 foram sensibilizados por via intraperitoneal com 10μg de OVA-Alum, aos dias 0, 7 e 14, e re-estimulados por via intranasal, aos dias 21, 22 e 23 com 50μg de OVA em solução salina. Como grupo de controlo, foram também incluídos no estudo ratinhos Thy1.1 não sensibilizados. Ao dia 24 todos os animais foram sacrificados por injecção letal, tendo sido recolhido sangue, pulmões, nódulos linfáticos e lavado broncoalveolar. Desta análise foi possível concluir que neste modelo de doença alérgica das vias respiratórias induzida por OVA se verifica um aumento na percentagem de eosinófilos presentes no lavado broncoalveolar, e infiltrado inflamatório junto das vias respiratórias. É igualmente visível um aumento das concentrações séricas de ambas as imunoglubulinas testadas. No entanto, este modelo não demonstra qualquer alteração nas concentrações de citocinas Th2 no pulmão. A possibilidade da ocorrência de uma resposta Th1 foi excluída pela ausência de IgG2a específica para OVA no soro dos animais sensitizados. Finalmente, para testar o possível impacto de células iNKT reguladoras Foxp3+, procedeu-se à transferência de células iNKT CD25+Foxp3+, células T CD4+CD25+Foxp3+ ou células iNKT Foxp3- por via intratraqueal para ratinhos Thy1.1 onde a doença alérgica das vias respiratórias foi induzida pelo protocolo descrito. A partir destes procedimentos foi possível verificar que, como esperado, ratinhos que receberam células T reguladoras apresentam um decréscimo na percentagem de eosinófilos presentes no BAL e menores infiltrados inflamatórios no pulmão, sendo também visível uma diminuição na concentração sérica de IgE. No caso de ratinhos para os quais foram transferidas células iNKT Foxp3+, estes demonstraram um ligeiro decréscimo quer na percentagem de eosinófilos presentes no BAL, quer no infiltrado inflamatório junto das vias respiratórias. Pelo contrário, a transferência de células iNKT Foxp3- não exerceu qualquer efeito sobre o número de eosinófilos, aumentando significativamente a concentração sérica de IgE. A presença das células transferidas foi confirmada pela sua presença nos nódulos linfáticos drenantes (nódulos linfáticos do mediastino). Em conclusão este estudo mostra que as células NKT invariantes Foxp3+ do fígado e do baço apresentam capacidade de conversão e fenótipo semelhante, partilhando muitas das suas características fenotípicas com as células T reguladoras. Estas células expressam também CXCR3 e CXCR6, mas não expressam CCR7 e poucas expressam CXCR5. Ao analisar o impacto das células NKT invariantes Foxp3+ na doença alérgica das vias respiratórias através de transferências adoptivas, foi possível concluir que estas parecem possuir a capacidade de diminuir ligeiramente a eosinofilia característica da doença. No entanto, esta é a única característica da doença onde estas células parecem ter algum impacto. O facto do modelo de doença alérgica das vias respiratórias utilizado não permitir o correcto estudo de respostas Th2, provavelmente devido ao facto da estirpe utilizada apresentar uma tendência para respostas Th1, sugere que mais experiências são necessárias, baseadas numa diferente estirpe de ratinho, para esclarecer de modo claro esta questão.
Foxp3+ invariant NKT cells are a subset of iNKT cells that display immunosuppressive properties. These cells share many phenotypic hallmarks with regulatory T cells, while retaining its NKT cell characteristics. Despite the fact that Foxp3+ iNKT cells have been already characterized, many phenotypical characteristics remained unstudied. Moreover, a possible impact of those cells in the prevention of inflammatory pathologies has never been addressed. A good model to test this issue is OVA-induced allergic airways disease in mice, where Foxp3+CD25+CD4+ T cells have been described to suppress some manifestations of the disease. Therefore, this work aimed to further characterize the Foxp3+ invariant NKT cell population and evaluate its impact in vivo on a mouse model of OVA-induced allergic airways disease. To obtain as many Foxp3+ invariant NKT cells as possible converted in vitro, sorted iNKT cells were cultured for 4 days with TGF-β, IL-2 and anti-CD28 in the presence of plate-bound anti-CD3. Upon conversion it was possible to show that there are no significant phenotypical differences between liver and splenic Foxp3+ iNKT cells, as both populations have similar expression of CD25, Nrp-1, CTLA-4, GITR, CD103, PD-1 and NKG2D, although differ in CD62L and NK1.1 expression. It was also shown that recent thymic emigrant iNKT cells are more prone to conversion into Foxp3-expressing iNKT cells. Regarding chemokine receptors, as iNKT cells, Foxp3+ iNKT cells express CXCR3 and CXCR6, do not express CCR7 and express almost no CXCR5, in the same way as Foxp3- NKT cells. Upon adoptive cell transfers of Foxp3+ iNKT cells, OVA-sensitized mice showed a small decrease airway eosinophila.
