Autor(es): Caldas, Paulo Renato dos Santos
Data: 2014
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/15404
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Calcitonina de salmão; Calcitonina humana; Hilyte fluor 488; Espectroscopia de fluorescência; Fibras amilóides; Interacção lípido-proteína; Modelo de membranas; Teses de mestrado - 2014
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014
A acumulação in vivo de agregados proteicos insolúveis, genericamente designados por fibras amilóides, são o principal fenótipo de várias doenças graves categorizadas como patologias amilóides, onde se incluem a doença de Alzheimer, Parkinson e diabetes Mellitus tipo II. Estas doenças representam um problema de saúde alarmante a nível mundial pelo que há um interesse clínico urgente e significativo em compreender os factores que desencadeiam a formação destas estruturas para se poder desenvolver meios farmacológicos adequados que possam diminuir, ou atenuar, estas patologias. A maioria destas doenças são predominantemente esporádicas e resultam de problemas no folding de proteínas específicas que levam à sua agregação, e consequente formação de depósitos/placas, criando condições patológicas em determinados tecidos humanos. Deste modo, uma das chaves fundamentais para se perceber o desenvolvimento destas doenças reside no estudo dos mecanismos moleculares que levam ao misfolding e agregação destas proteínas in vitro. Estudos recentes mostraram que o estabelecimento de interacções lípido- péptido/proteína podem induzir um decréscimo na barreira de energia associada ao unfolding proteico, conduzindo à destabilização da estrutura nativa das proteínas/péptidos, e consequente misfolding. Com efeito, tem sido demonstrado que as membranas biológicas são capazes de promover a conversão de proteínas/péptidos em agregados tóxicos actuando como catalisadores do seu processo de fibrilhação, dependendo da composição lipídica da membrana (características estruturais dos seus lípidos componentes). No entanto, os mecanismos detalhados através dos quais a acumulação destes agregados compromete a integridade das membranas lipídicas ainda permanecem por esclarecer. Uma importante linha de investigação desenvolvida ao longo dos últimos anos no laboratório de acolhimento tem estado, precisamente, focada no estudo dos mecanismos que podem levar à formação de estruturas amilóides desencadeados pelo estabelecimento de interacções entre proteínas não amiloidogénicas e membranas carregadas negativamente, sob condições próximas das fisiológicas. O objectivo deste trabalho, que visou dar continuidade a este tópico, centrou-se no uso da calcitonina (CT) como polipéptido modelo para se estudar a capacidade das membranas lipídicas aniónicas em modularem a sua via de agregação em solução. Neste estudo foram empregues ambas as variantes humana (hCT) e de salmão (sCT) desta hormona polipeptídica. A CT é uma hormona com 32 resíduos de aminoácidos libertada pela glândula tiróide e que tem um papel importante no metabolismo do cálcio, sendo por isso administrada no tratamento da osteoporose e hipercalcemia. Nos últimos anos, a variante humana da calcitonina (hCT) tem sido cada vez menos utilizada neste tipo de tratamentos devido à sua tendência elevada em formar agregados que podem conduzir, eventualmente, à formação de depósitos de placas amilóides. Recentemente, a calcitonina de salmão (sCT) tem sido usada como uma alternativa clínica à hCT devido à sua maior potência farmacológica e menor tendência em sofrer agregação. Com efeito, a hCT é geralmente considerada um péptido amiloidogénico, o que a torna um modelo peptídico ideal para este tipo de estudo. Por outro lado, a sCT é útil devido ao facto de sua cinética de fibrilhação em solução ser muito mais lenta do que a da hCT permitindo, eventualmente, estudar em detalhe estados intermediários da cinética. Neste trabalho, os polipéptidos sCT e hCT foram utilizados quer na sua forma nativa (não derivatizada), quer conjugados com o fluoróforo HiLyte Fluor 488 (HL488) nos seus resíduos N-terminal (hCT-HL488 e sCT-HL488, respectivamente). A escolha desta posição de derivatização da CT visou minimizar a possibilidade de o fluoróforo conjugado interferir na formação de estruturas , já que é conhecido que esta envolve a sequência C-terminal destes polipéptidos (resíduos 25-32). Deste modo, através da realização de medidas de fluorescência em estado estacionário e resolvidas no tempo, com o fim de caracterizar as propriedades de emissão de fluorescência intrínsecas e extrínsecas destes polipéptidos, procurou-se obter informação sobre (i) o seu estado de agregação em solução, e (ii) sobre o modo como a sua interacção com lipossomas era condicionada pela sua composição lipídica, nomeadamente pelo seu conteúdo em fosfolípidos aniónicos. Os estudos de partição foram realizados utilizando-se vesículas unilamelares grandes (LUVs) como sistema modelo de membranas, preparadas com uma composição lipídica variável, nomeadamente misturas de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), um fosfolípido zwitteriónico, com 0, 10, 20 ou 30 mol% de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoserina (POPS), um fosfolípido aniónico. Este tipo de vesiculas têm sido maioritariamente usadas para estudar interacções de péptidos com as membranas devido ao seu tamanho adequado (100 nm) e grau de curvatura, por comparação com outros sistemas vesiculares como, por exemplo, as vesículas unilamelares pequenas (SUVs) e gigantes (GUVs). Numa primeira fase do trabalho, explorou-se a fluorescência intrínseca da sCT e hCT devida à presença de um resíduo de tirosina na estrutura primária de cada uma destas formas de calcitonina (Tyr22 e Tyr12, respectivamente). Foi realizada uma caracterização espectroscópica sumária das suas propriedades de emissão de fluorescência em solução tampão e efectuou-se ainda um estudo da sua partição para LUVs de POPC contendo 20 mol% de POPS através da monitorização da sua anisotropia de fluorescência em estado estacionário. Após se ter minimizado experimentalmente o impacto da dispersão da radiação (scattering) causada pelas suspensões de lipossomas no valor deste parâmetro, recuperou-se um valor de =(5.5±0.3)x105 para a sCT. Curiosamente, a variante humana, hCT, não mostrou qualquer tipo de interacção com os lipossomas preparados com uma composição lipídica idêntica, não havendo variações significativas em nenhum dos parâmetros espectroscópicos estudados com o aumento da concentração de fosfolípido no sistema. Este tipo de metodologia oferece a vantagem de não ser necessário usar fluoróforos extrínsecos ligados covalentemente à sequência peptídica, o que pode causar perturbações na estrutura nativa em solução. Contudo, a fluorescência intrínseca de ambas as variantes CT é pouco eficiente devido aos baixos coeficientes de absorção molar e rendimentos quânticos dos seus resíduos de Tyr, tornando a realização de medidas de fluorescência na presença de vesiculas lipídicas problemática uma vez que, aos comprimentos de onda usados, estas provocam um elevado nível de scatter no sistema. Por outro lado, as propriedades espectroscópicas deste fluoróforo intrínseco das proteínas são ainda caracteristicamente pouco sensíveis a pequenas alterações na polaridade do seu microambiente directo. Deste modo, o trabalho prosseguiu com o estudo das duas variantes de calcitonina derivatizadas, sCT-HL488 e hCT-HL488, respectivamente. Devido ao facto de a sonda fluorescente utilizada ter sido comercializada recentemente, não há muita informação disponível na literatura. A segunda fase do trabalho iniciou-se então com a realização de um estudo da variação das propriedades espectroscópicas da sonda livre HL488 e de ambas as variantes CT derivatizadas numa série de solventes para apurar o seu comportamento em meio homogéneo em função das propriedades do solvente. Neste estudo, foi usada uma variedade de álcoois com diferentes tamanhos de cadeia alifática (metanol, etanol, propanol, butanol) e fluoro álcoois (trifluoroetanol (TFE) e hexafluoroisopropanol (HFIP)), além de soluções tampão preparadas com força iónica variável. Relativamente à sonda livre, os seus espectros de absorção e de emissão de fluorescência apresentaram um desvio batocromático progressivo com a diminuição da constante diéletrica dos álcoois alifáticos estudados. Contudo, na presença dos dois fluoro álcoois, ambos os espectros da sonda livre apresentaram um desvio hipsocromático significativo relativamente ao seu comportamento em solução aquosa, o que poderá ser devido à capacidade conhecida destes solventes em estabelecerem pontes de hidrogénio. Por outro lado, a sonda apresentou sempre um decaimento de intensidade de fluorescência mono-exponencial, com um tempo de vida próximo de 3.9ns em todos os solventes estudados, excepto em glicerol. A medição de espectros de emissão resolvidos no tempo (TRES) confirmou que os decaimentos complexos apresentados pelo fluoróforo livre em glicerol eram devidos a um efeito de relaxação do solvente devido à sua viscosidade elevada. Ainda nesta fase, o espectro de excitação da anisotropia em estado estacionário da sonda foi medido em glicerol para se obter o valor da sua anisotropia fundamental em função do comprimento de onda de excitação. Com os dados obtidos, foi possivel (i) concluir que os momentos dipolares das transições S1So e S2So da sonda HL488 estão orientados perpendicularmente entre si, e (ii) prever assim o impacto da necessidade de se usar diferentes comprimentos de onda de excitação nas medidas de anisotropia em estado estacionário e resolvidas no tempo nos estudos que foram realizados posteriormente. O comportamento obtido para a variação das propriedades espectrais de ambos os péptidos derivatizados com o solvente usado foi muito idêntica à descrita anterioremente para a sonda livre HL488. No entanto, os péptidos sCT-HL488 e hCT-HL488 apresentaram agora um decaimento de intensidade de fluorescência complexo na maioria dos solventes estudados, embora sempre com uma componente dominante com ~3.9ns (com contribuição variável para a intensidade de fluorescência total consoante o solvente). Este comportamento foi discutido em termos da possibilidade de ocorrência de um mecanismo de extinção de fluorescência (quenching estático ou dinâmico) da sonda usada devido a um processo de transferência electrónica fotoinduzida (PET) por possíveis resíduos de aminoácidos presentes no esqueleto polipeptídico das CTs. A conformação adoptada pelos polipéptidos, assim como as flutuações dinâmicas da cadeia polipeptídica, são altamente dependentes da polaridade e viscosidade do solvente, influenciando a eficiência dos mecanismos PET, que caracteristicamente decorrem do estabelecimento de interacções de curto alcance. Finalmente, constatou-se que o estado de agregação de ambos os péptidos em solução aquosa não variava numa gama alargada de concentrações (1nM to ~8μM) pois a sua anisotropia de fluorescência em estado estacionário era constante. A redução da ponte persulfureto também não influenciou de modo dramático a dinâmica rotacional de ambos os polipéptidos derivatizados em solução aquosa, tendo-se concluído que estes adoptavam uma conformação relativamente compacta a partir da realização de medidas de anisotropia resolvidas no tempo. Por último, os péptidos derivatizados foram usados em estudos de partição através da realização de medidas da sua fluorescência extrínseca em estado estacionário e resolvidas no tempo. Foi avaliado o impacto da concentração de péptido no sistema, assim como da composição lipídica das membranas: usaram-se lipossomas compostos por POPC com proporções variáveis de POPS (0, 10, 20 e 30 mol%), que foram adicionados a uma concentração fixa de sCT-HL488 ou hCT-HL488 em tampão HEPES-KOH, pH 7.4. Tal como se verificou nos estudos em que se explorou as propriedades de fluorescência intrínseca da hCT, não houve qualquer tipo de alteração espectral nas medidas de absorção UV-VIS ou emissão fluorescência, assim como na variação da anisotropia em estado estacionário, com o aumento da concentração de vesiculas de POPC:POPS 70:30 nos estudos realizados com o péptido humano (1μM hCT-HL488). Mesmo aumentando a carga negativa das vesiculas para 50% (POPC:POPS 50:50) não se observou qualquer interacção do péptido com as membranas. Mostrou-se assim que carga negativa promovida pelo POPS não é suficiente para desencadear uma ligação do péptido humano às membranas, e que os mecanismos de interacção descritos na literatura se devem provavelmente a variações na composição lipídica, como a inclusão de colesterol e/ou gangliósidos nas membranas, que têm a capacidade de potenciar as interacções membrana-péptido. O mesmo desenho experimental, utilizando-se agora sCT-HL488 (0.2, 1μM e 3.4μM) mostrou um desvio para o vermelho no seu espectro de absorção UV-VIS com o aumento da concentração de vesiculas contendo proporções variáveis de POPS (10, 20 e 30 mol%) associado à mudança de polaridade do microambiente da sonda covalentemente ligada. Em concordância, o valor de anisotropia em estado estacionário e da anisotropia residual revelaram também um aumento em função da adição de vesiculas ao meio, revelando assim adsorção do péptido às membranas aniónicas. O coeficiente de partição estimado a partir da variação do valor de anisotropia em estado estacionário mostrou aumentar em função da percentagem de POPS presente nas vesiculas, indicando que as interacções electrostáticas são as principais responsáveis pela interacção membrana-péptido. Recuperou-se ainda um valor de =(3.1±0.2)x105 e =(2.9±0.3)x105 nos estudos realizados com 1.0 e 3.4μM de sCT-HL488, respectivamente, na interacção com vesiculas de POPC:POPS 80:20. Sendo este valor muito semelhante ao valor recuperado anteriormente nos estudos com a fluorescência intrínseca, é um indicativo de que a ligação da sonda ao péptido não altera significativamente a sua partição para as membranas. A emissão de fluorescência em estado estacionário de 1 e 3.4μM de sCT-HL488 em interacção com LUVs de POPC contendo 20mol% de POPS mostrou um comportamento bifásico, com um decréscimo acentuado para ~80 e ~60%, respectivamente, do valor inicial em solução aquosa, quando baixas concentrações de lípido foram adicionadas ao sistema. Com o aumento da concentração de vesiculas em solução, o valor de emissão de fluorescência foi progressivamente recuperado. Concomitantemente, o valor médio do tempo de vida de sCT-HL488, para ambas as concentrações utilizadas, não variou significativamente com o aumento da concentração de lípido. Estes resultados mostraram que, para concentrações de péptido em solução elevadas (relativamente à concentração de vesiculas aniónicas), a sCT-HL488 sofre quenching estático, indicando a formação de complexos escuros na superfície membranar. Adicionalmente, foi ainda possível identificar o estabelecimento de interacções excitónicas (formação de agregados tipo H) sob as mesmas condições experimentais, corroborando a formação de agregados de sCT-HL488 na membrana. Utilizando concentrações mais baixas de sCT-HL488 (0.2μM), observámos ainda que o método de preparação das amostras influenciava criticamente a sua cinética de interacção com as membranas lipídicas aniónicas. Apesar de debatida, a razão por detrás deste comportamento não foi completamente esclarecida. Em resumo, mostrou-se que, apesar de a calcitonina humana não interactuar com membranas aniónicas, estas têm a capacidade de induzir a partição de sCT-HL488 acoplada a um mecanismo de oligomerização dependente da concentração de péptido e de lípido no sistema, como já descrito na literatura para outros tipos de péptido. Concentrações de péptido críticas levam à agregação de monómeros na superfície das membranas aniónicas que não são fluorescentes. A identificação deste tipo de intermediários oligoméricos pode ter um papel importante na via de fibrilhação da CT mediada por membranas e/ou contribuir directa ou indirectamente para a sua toxicidade celular.
Recent studies have suggested that biological membranes can stimulate the pathological conversion of amyloidogenic proteins/peptides into toxic aggregates by providing a soft surface that can promote their misfolding and self-assembly. These interactions can be controlled by a range of biophysical features arising from the specific lipid composition of the membrane. In this work, both salmon and human calcitonins (sCT and hCT) were used as model polypeptides to study the role that negatively-charged lipid membranes can play in modulating their aggregation pathway. Specifically, a multi-parametric study based on steady-state and time-resolved fluorescence intensity and anisotropy measurements was carried out to study the interaction of both unlabelled and HiLyte Fluor 488-labelled sCT and hCT polypeptides (sCT-HL488 and hCT-HL488, respectively) with liposomes prepared with a variable anionic lipid content. The influence of a small set of solvents, namely several aliphatic and fluoro alcohols, on the photophysical properties of both the free HL488 dye and both HL488-labeled CT variants was first characterized. The changes in the fluorescence intensity decay kinetics displayed by the fluorescently-labelled peptides with the solvent used were assigned to an intramolecular photon-induced electron transfer mechanism dependent on the conformational dynamics of the polypeptide chain. In the second part of this work, the interaction of sCT-HL488 with lipid membranes was found to be critically dependent on the method used to prepare the samples (direct injection vs solvent evaporation). CT binding to liposomes was also established to be dominantly driven by electrostatic interactions. Furthermore, a coupled partition/oligomerization model was used to describe the biphasic fluorescence intensity data obtained when high sCT-HL488 concentrations were used in the partition studies. The excitonic band detected in the absorption spectra of sCT-HL488 at a high P/L molar ratio (low phospholipid concentrations) revealed the formation of parallel (H-type) dimers between the HL488 chromophores covalently linked to sCT, which were non-fluorescent.
