Tropism based analysis of Chlamydia trachomatis chromosome

• Autor(es): Varela, Minia Antelo, 1989-
• Data: 2014
• Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/15786
• Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
• Assunto(s): Chlamydia trachomatis; Virulência; Mutação genética; Teses de mestrado - 2014
• Tipo de Documento: Dissertação de mestrado
• Idioma: Inglês
• Orientador(es): Gomes, João Paulo dos Santos, 1971-; Dionísio, Francisco, 1971-
• Contribuidor(es): Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Alguns microrganismos possuem vários fatores de virulência que lhes conferem a capacidade de infetar de forma específica nichos biológicos distintos. Chlamydia é um excelente exemplo para representar esta competência, uma vez que evoluiu de forma a poder colonizar diversos grupos de animais vertebrados. Trata-se de um género bacteriano gram-negativo e intracelular obrigatório, com um ciclo de vida bifásico único entre os procariotas, de 30 a 72 horas. Apresenta duas formas celulares morfologicamente distintas: forma extracelular infeciosa, o corpo elementar e uma forma replicativa não-infeciosa, o corpo reticulado. Ao longo do desenvolvimento, a bactéria reside e multiplica-se dentro de um vacúolo - a inclusão, e manipula a célula hospedeira através de um sistema de secreção do tipo III (T3SS) pela translocação de proteínas efetoras para o interior da célula hospedeira. Embora a história taxonómica deste género bacteriano tenha sido controversa, propôs-se recentemente que a família das Chlamydiaceae fosse agregada num único género, Chlamydia, incluindo nove espécies com um largo espetro de hospedeiros e de patologias: C. muridarum, C. suis, C. pecorum, C. caviae, C. psittaci, C. abortum, C. felis, C. pneumoniae e C. trachomatis, sendo esta última o foco do nosso estudo, dado tratar-se da única espécie que infecta estritamente o homem e cujas infeções constituem um sério problema de saúde pública. Chlamydia trachomatis é classificada em 15 serovars principais, de acordo com o serotipo diferencial da MOMP (proteína principal da membrana externa). Os serovars de A a C infetam a conjuntiva ocular, provocando o tracoma, que é a principal causa de cegueira susceptível de prevenção em todo o mundo; os serovars D a K estão associados às infeções ano-urogenitais não invasivas, constituindo a primeira causa de doenças bacterianas sexualmente transmissíveis a nível mundial; finalmente, os serovars L1 a L3 são responsáveis por doenças mais invasivas e sistémicas, tais como o linfogranuloma venéreo (LGV), através da infeção do tecido genital e proliferação para os nódulos linfáticos inguinais. O genoma de C. trachomatis, o qual foi sequenciado em 1998, tem aproximadamente 1-Mpb, o que é considerado pequeno para uma bactéria, resultando dum processo de redução evolutiva aquando da transição deste patogéneo para o meio intracelular. Esta bactéria contém também um plasmídeo altamente conservado com ~7,5 kb, que codifica para 8 genes, dois dos quais (pgp3 a pgp4) já tendo sido implicados em funções de virulência. Apesar das diferenças biológicas dos vários serovars de C. trachomatis em relação ao seu tropismo, virulência e sucesso ecológico, estes apresentam um elevado grau de similaridade genómica (>98%). Assim, pensa-se que estas discrepâncias fenotípicas tenham origem em polimorfismos genéticos específicos (mutações pontuais ou pequenos eventos de inserção/deleção) circunscritos aos restantes 2% do genoma. Neste âmbito, este estudo visa avaliar quais os genes que possam estar envolvidos nas diferenças de tropismo, virulência e sucesso ecológico entre os diversos serovars de C. trachomatis, sendo dividido em duas partes. Na primeira parte estudámos todos os ~900 genes de C. trachomatis, tanto a nível filogenético, como evolutivo, para avaliar a sua possível associação com apetência celular e sucesso ecológico, tendo como base cerca de 50 genomas totalmente sequenciados que estão disponíveis no GenBank. Vimos que apenas ~1% dos genes mostram ter uma segregação filogenética dos três grupos de doença (agrupando diferencialmente estirpes que infetam a conjuntiva ocular, o epitélio genital e os nódulos linfáticos). Por outro lado, aproximadamente 80% dos genes segregam as estirpes de LGV, e 28% de todos os genes, incluindo a maioria dos efetores do T3SS e proteínas da inclusão de membrana, as agrupam de forma exclusiva. Metade dos genes estão envolvidos na segregação das estirpes dos serovars genitais mais prevalentes, mas apenas 61 proteínas exibem este padrão mutacional de forma exclusiva. Notavelmente, estas últimas mostraram ser co-segregadas com as estirpes LGV por ~20% dos genes, o que não deixa de ser curioso, tendo em conta o carácter mais invasivo destas últimas. Identificámos também alguns pseudogenes, especificamente associados a estirpes com determinado tipo de tropismo. Aproximadamente 3.5% dos genes mostraram uma sobre representação de mutações não-sinónimas, onde a maioria codifica proteínas que interagem diretamente com o hospedeiro. Globalmente, esta previsão in silico dos genes de C. trachomatis associados a um fenótipo específico pode constituir uma importante base de dados, abrindo portas para futuros estudos cujo objetivo seja o desenvolvimento de medidas profiláticas para o combate às infeções por esta bactéria. A segunda parte deste trabalho foca-se na avaliação da dinâmica genómica de C. trachomatis, subjacente à adaptação ao meio laboratorial. Este tipo de estudos de evolução adaptativa in vitro têm permitido recolher conhecimento importante relativo à base molecular subjacente a processos de evolução microbiana, podendo posteriormente relacioná-lo com dinâmicas adaptativas ocorrentes em populações naturais. Demonstram normalmente a existência de alterações fenotípicas tipicamente observadas em populações propagadas em laboratório, nomeadamente o desenvolvimento de novas capacidades metabólicas, o desenvolvimento de resistência/sensibilidade a antibióticos e perda geral de virulência. Estas características têm sido exploradas pelos investigadores, de forma a esclarecer mecanismos subjacentes ao processo de infeção, e descobrir novos genes de virulência, uma vez que a sua perda de função poderá estar possivelmente relacionada com a sua dispensabilidade no meio in vitro, corroborando o facto de que estes genes possam ter um papel essencial in vivo. Foram utilizadas neste estudo de propagação laboratorial intensiva e de análise genómica comparativa (sequenciação genómica total das estirpes antes e após a sua propagação laboratorial), estirpes com características de tropismo diferentes, nomeadamente seis estirpes representativas dos três grupos de doença (4 urogenitais não-invasivas, uma ocular e uma LGV). Propagámos as estirpes através de 30 passagens in vitro de forma a perceber quais os mecanismos que levam à acumulação de mutações ao longo da passagem laboratorial. Detetámos a emergência de clones com mutações inativantes no gene CT135 (previamente descrito como potencial fator de virulência), para todas as estirpes urogenitais, mas não para as restantes estirpes (oculares e LGV), sendo que os mutantes CT135-nulos subiram rapidamente a sua frequência na população. Ocorreu um cenário semelhante para o gene CT713/porB, em que 3 das 4 estirpes urogenitais não invasivas foram alvo de possíveis mutações inativantes, um panorama que possivelmente reflete um processo de adaptação metabólica, dado que este gene está associado ao transporte de dicarboxilatos. Detetámos também dois genes que foram alvos de mutações inativantes: CT257 e CT645, indicando que estes genes não são essenciais para o crescimento in vitro de C. trachomatis. Curiosamente, a estirpe ocular C/TW-3 evoluiu de forma a reter um gene CT135 funcional, opostamente à estirpe LGV, que não mostrou o aparecimento de qualquer mutação. Também verificámos que a taxa de crescimento para as estirpes propagadas in vitro aumentou relativamente às populações ancestrais, refletindo uma melhoria gradual do fitness ao longo do tempo. Globalmente, esta segunda parte do trabalho contribui para a compreensão de alguns mecanismos subjacentes à adaptação laboratorial de C. trachomatis e corrobora o papel do gene CT135 como um importante fator de virulência. Também identifica possíveis problemas em relação à interpretação de resultados de estudos in vivo que usam estirpes propagadas em laboratório. De uma forma geral, pensamos que este trabalho possa fornecer novo conhecimento em relação aos genes que possam estar envolvidos nos processos de tropismo diferencial, sucesso ecológico e virulência dos diversos serovars de C. trachomatis, abrindo novos caminhos de pesquisa para estabelecer associações entre genótipo e fenótipo.