Autor(es): Cavaco, Ana Rita Sebastião Mendes
Data: 2015
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/22439
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Sintase do óxido nítrico; Leishmania infantum; Estrutura; Análise bioinformática; Espetrometria de massa; Teses de mestrado - 2015; Departamento de Química e Bioquímica
Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
O óxido nítrico (NO) tem um grande impacto nos seres vivos. No Homem, o NO participa em vários processos fisiológicos, como a regulação da pressão sanguínea, a neurotransmissão e a resposta imune. Nestes processos, o NO funciona como uma molécula sinalizadora. No entanto, em níveis mais elevados, este radical pode ter efeitos tóxicos nas células, fazendo parte da resposta de defesa contra mcirorganismos patogénicos. De facto, há um consenso de que, nas infeções por Leishmania e Trypanosoma cruzi, o NO produzido pelos macrófagos infetados medeia a morte dos parasitas. Em parasitas do género Leishmania, o NO é ainda importante na interação entre o parasita e o hospedeiro. Para além disso, sabe-se atualmente que a concentração de NO produzido pelos parasitas varia ao longo do seu ciclo de vida, sendo tanto maior quanto maior é a sua infetividade. Assim, o NO assume um papel importante no estabelecimento da infeção por Leishmania. O enzima sintase do óxido nítrico (NOS, EC: 1.14.13.39), que catalisa a reação de formação de NO a partir de L-arginina, é, portanto essencial para o parasita. Atualmente, sabe-se que não existe homologia de sequência entre o NOS de Leishmania infantum (LiNOS) e de humano. Neste sentido, o LiNOS surge como um potencial alvo terapêutico para o combate da leishmaniose visceral, doença pela qual o parasita é responsável. Neste projeto foi demonstrado, pela primeira vez, que o LiNOS expresso nativamente forma um homotetrâmero. Foi ainda possível concluir que o tetrâmero de LiNOS é estabilizado na presença de heme e de tetrahidrobiopterina. Através da análise da sequência da proteína em estudo, foi prevista a existência de uma região desordenada entre os resíduos 210 e 270 e de um segmento transmembranar entre os resíduos 424 e 446. Na análise das regiões desordenadas do LiNOS, foi também identificado um local de ligação a montante e/ou a jusante desta região, sendo esta ligação potencialmente estabelecida com a caveolina. A estrutura tridimensional do monómero de LiNOS foi ainda prevista por homologia, tendo sido possível prevê-la para a maioria da sequência (resíduos 95-584). Os resultados obtidos permitiram gerar informação crucial para dirigir os próximos passos experimentais no sentido da sua elucidação total, assim como de outros aspetos relacionados com a função.
Nitric oxide (NO) exerts a great impact on living beings. On human cells, NO participates in several physiological processes, such as blood pressure regulation, neurotransmission and immune response. In these processes, NO works as a signaling molecule. However, when in higher levels, this radical can exert toxic effects on cells as part of the immune response against pathogenic microorganisms. In fact, that is a consensus that, in infections by Leishmania and Trypanosoma cruzi, NO produced by infected macrophages mediates parasite death. In Leishmania genus parasites, NO is also important for the parasite-host interaction. Besides, it is now known that the concentration of NO produced by the parasites varies during its life cycle and it increases as the parasite’s infectivity increases. Hence, NO plays an important role on the establishment of the infection by Leishmania. The enzyme nitric oxide synthase (NOS, EC: 1.14.13.39), wich catalizes the synthesis of NO from L-arginine, is essential for the parasite. At this time, it is known that Leishmania infanum NOS (LiNOS) has no sequence homology with human NOS. Therefore, LiNOS arises as a potential therapeutic target for the treatment of visceral leishmaniasis, the desiese for wich the parasite is responsible. It was established during this project, for the first time, that natively expressed LiNOS folds as a homotetramer. It was also possible to conclude that the tetramer is stabilized when in presence of heme and tetrahydrobiopterine. A protein sequence analysis revealed the existence of a disordered region between residues 210 and 270 and a transmembrane region between residues 424 and 446 was predicted. When analysing disordered regions in LiNOS a potential binding site upsteam and/or downstream the predicted region was identified and the bond might me established with caveoline. The tridimentional structure of LiNOS monomer was predicted by homology, and it was possible to predict it for the majority of the sequence (residues 95 to 584). The acquired results led to the generation of crutial information to lead the next experimental steps for the structure’s complete elucidation, as wel as other function related aspects.
