Autor(es): Gonçalves, Maria Inês Cardoso
Data: 2017
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/31528
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1); Cinase dependente de DNA (DNA-PK); Transativador do LTR do HIV-1 (Tat); Elementos cis; Proteína de especificidade 1 (Pp1); Teses de mestrado - 2017; Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas
Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
O DNA-PK (Cinase dependente de DNA) é um complexo proteico nuclear que requer uma associação com o DNA para exercer a sua atividade cinásica. Este complexo é constituído por duas componentes: uma subunidade catalítica de 450 kDa (DNA-PKcs) que se trata de uma cinase de serinas e treoninas, e um heterodímero regulador designado por autoantigénio Ku composto por duas subunidades (Ku70/80). Atualmente, sabe-se que DNA-PK participa em vários processos celulares, nomeadamente ao nível do controlo da transcrição, na regulação dos genes do metabolismo celular e na manutenção dos telómeros. No entanto, a sua principal função está relacionada com a reparação de quebras de cadeia dupla no DNA, através do mecanismo NHEJ (Non-homologous end joining), que é crucial para a integridade dos linfócitos e para a reparação de quebras de dupla cadeia no DNA. Em consequência, levantou-se a hipótese do envolvimento de DNA-PK no processo de integração do provírus do HIV-1, mas os resultados obtidos geraram controvérsia. Anteriormente, neste laboratório, surgiram evidências de que DNA-PK poderia estar envolvido na transcrição, a partir do LTR do HIV-1 (HIV-1 Long-Terminal Repeat): observou-se que o silenciamento de DNA-PKcs, através da aplicação de shRNA, resulta numa diminuição dos níveis de transcrição viral. No entanto, os mecanismos subjacentes à função deste complexo no processo de transcrição ainda estão por esclarecer. Neste estudo, examinou-se a capacidade do complexo DNA-PK modular a atividade transcricional, a partir do promotor localizado ao nível do LTR viral. Para isso, transfetaram-se células HeLa-P4 e TZM-bl com várias quantidades do plasmídeo pCMV6DNA-PKcs (0,25 e 0,5 μg) apenas ou na presença de pCMV-Tat, que expressa Tat, o transativador do LTR. Os resultados destas experiências demonstraram que DNA-PK não tem a capacidade de transativar, por si só, o LTR do HIV-1 e o promotor pCMV, existente nos plasmídeos pCMV-Tat e pCMV6DNA-PKcs. Para além disto, observou-se um aumento dos níveis de transativação, a partir do LTR viral, na presença de pCMV-Tat e pCMV6DNA-PKcs, apenas nas células TZM-bl que têm um LTR do HIV-1 integrado completo (nt -454 a +181). As células HeLa-P4 também têm um LTR integrado mas de tamanho pequeno (nt -138 a +80), o que indica que podem existir elementos cis em falta neste LTR, necessários para a sinergia observada entre a proteína Tat e o complexo DNA-PK, no processo de transcrição, a partir do LTR do HIV-1. Para confirmar estes resultados, foram produzidos três LTR de diferentes tamanhos e posteriormente, células 293T foram transfetadas com cada um dos LTR em separado e duas quantidades de pCMV6DNA-PKcs (0,25 e 0,5 μg), apenas ou na presença de pCMV-Tat. Contrariamente aos resultados obtidos previamente, verificou-se que afinal o LTR pequeno (nt -138 a +80), presente nas células HeLa-P4, tem os elementos cis suficientes para o aumento da transativação do LTR viral, mediada por Tat, na presença de DNA-PK. Estudos recentes demostraram que três locais de ligação para o fator de transcrição Sp1 (Proteína de Especificidade 1) no promotor, e dois locais de ligação para NF-kB, na região enhancer, parecem ser os elementos chave envolvidos na regulação da transcrição viral, a partir do LTR do HIV-1. Para além disto, Tat e DNA-PK parecem interagir, aumentando o estado de fosforilação de Sp1, que resulta no aumento da expressão do LTR viral. Colocou-se então a hipótese dos locais de ligação para Sp1 corresponderem aos elementos cis responsáveis pelo aumento da transativação do LTR pela Tat, na presença de DNA-PKcs. Deste modo, construiu-se um novo LTR apenas com os três locais de ligação para o fator de transcrição Sp1, presentes na região nuclear do promotor viral, através de experiências de clonagem simples. Uma vez construído o novo LTR, ao qual se atribui a designação de LTRSp1, transfetaram-se células 293T com este LTR e duas quantidades de pCMV6DNA-PKcs (0,25 e 0,5 μg) apenas ou na presença de Tat. Os resultados destas experiências demonstraram que houve atividade sinergética entre Tat e DNA-PK, que leva ao aumento da transativação do novo LTR viral. Por último, experiências recorrendo ao inibidor NU7026, específico para a atividade catalítica de DNA-PK, permitiram concluir que é a subunidade catalítica deste complexo (DNA-PKcs) que está envolvida no aumento dos níveis de transativação viral. Em qualquer conjunto de experiências efetuadas, no decorrer deste estudo, não se observou transativação do LTR do HIV-1 e do promotor pCMV, existente nos plasmídeos pCMV-Tat e pCMV6DNA-PKcs, apenas na presença do complexo DNA-PK. Finalmente, a viabilidade celular não foi afetada pelos plasmídeos pCMV-Tat e pCMV6DNA-PKcs. No geral, este trabalho permitiu identificar alguns dos elementos cis necessários para a sinergia observada na transativação do LTR do HIV-1, na presença de Tat e DNA-PK, o que facilitará a descoberta com maior precisão de outros fatores de transcrição envolvidos no processo e novas vias de sinalização subjacentes.
DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) is a multimeric complex composed by a 450 kDa catalytic subunit (DNA-PKcs), and by a regulatory DNA-binding heterodimer Ku70/80. DNA-PK is a Ser/Thr kinase identified as a crucial regulator of the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA-repair. More recently, DNA-PK has also been described to participate in diverse other cellular functions such as telomere maintenance, metabolic gene regulation and transcriptional control, becoming clear that its cellular activity goes far beyond its role in DNA double-strand break repair. DNA-PKcs has been suggested to have a role in HIV-1 life cycle by either helping the virus integration in genomic host DNA or in the HIV-1 Long Terminal Repeat (LTR)-driven transcription. We have previously shown that DNA-PKcs knockdown impairs HIV-1 LTR-driven transcription. However, the underlying mechanisms whereby DNA-PKcs helps HIV-1 transcription are still unclear. In this study, we have examined the capacity of DNA-PKcs to modulate transcriptional activity of the HIV-1 promoter sequence located within the LTR. For this, HeLa P4 and TZM-bl cells with an integrated minimal (-138 to + 80) and a full length (-450 to +96) HIV-1 LTR promoter were transfected with several amounts of PCMV6DNA-PKcs (0.25 and 0.5 μg) alone or in the presence of Tat, the LTR transactivator. Our results show that DNA-PKcs only enhanced Tat-full length LTR driven transcription suggesting that HIV-1 promoter sequence not present in a minimal LTR is needed to observe a synergism between DNA-PKcs and Tat on LTR transcription. To confirm these results, 293T cells were co-transfected with several constructs of LTR with different lengths and Tat alone or in the presence of DNA-PKcs (0.25 and 0.5 μg). However, and in contrast with our previous results, we observed that the cis-elements presents in a minimal LTR are sufficient for the DNA-PKcs enhancement of Tat LTR-driven transcription. Early reports showed the three Sp1 core promoter binding sites and two NF-kB core enhancer motifs to be key elements involved in the regulation of HIV-1 transcription. Besides that, Tat and DNA-PK may seem to interact to increase the phosphorylation state of the Specificity protein 1 (Sp1), leading to an increase in Tat-full length LTR driven transcription. Therefore, we hypothesized that the three Sp1 binding sites could be the cis-elements present in the minimal LTR responsible for DNA-PKcs increase in LTR transcription mediated by Tat. To accomplish that, we have constructed a new LTR with only the three Sp1 core binding sites, through simple cloning experiments. Once constructed the new LTR named LTRSp1, 293T cells were co-transfected with this LTR with different lengths and Tat alone or in the presence of DNA-PKcs (0.25 and 0.5 μg). The results showed a synergism between Tat and DNA-PK, resulting in the enhancement of Tat-LTRSp1 driven transcription. At last, experiments with NU7026, a DNA-PKcs-specific inhibitor, showed that the catalytic subunit is responsible for the increase of Tat-LTR transactivation. In each set of experiments, it was not observed LTR or pCMV transactivation by pCMV6DNA-PKcs itself. Finally, the cellular viability was not affected by the plasmids pCMV-Tat and pCMV6DNA-PKcs. Overall, this work was important to identify one of the cis-elements responsible for the synergism between Tat and DNA-PK, leading to the enhancement of Tat-LTR driven transcription. Discovering the cis elements will possibly reveal other transcription factors involved in the DNA-PK enhancement process and new signaling pathways.
