Autor(es): Cordeiro, André Miguel Henriques
Data: 2009
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/4573
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Fitoceramida; Jangadas lipídicas; Sonda de potencial de membrana Di-4-ANEPPS; Espectroscopia de fluorescência; Ergosterol; Teses de mestrado - 2009
Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009
Na membrana plasmatica de Saccharomyces cerevisiae já foram identificados domínios lipídicos compostas maioritariamente por esteróis e/ou esfingolípidos, podendo apresentar-se organizadas duma forma semelhante a uma fase líquido ordenado (lo). No entanto, os princípios biofísicos da formação e funcionamento desses domínios ainda nao são totalmente conhecidos. Neste trabalho foram utilizadas técnicas de espectroscopia de fluorescência em estado estacionário e resolvidas no tempo para caracterizar propriedades biofísicas de diversas misturas lipídicas que mimetizam os domínios da membrana plasmática da levedura, de modo a esclarecer aqueles princípios. Foram estudados os sistemas binários 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3- fosfocolina (POPC)/ ergosterol e POPC/ fitoceramida, que mimetizam o papel dos esteróis e esfingolípidos na formação de domínios, respectivamente, com as sondas ácido trans-parinárico (t-PnA) e difenil-hexatrieno (DPH). Confirmou-se a formação de uma fase lo induzida pelo ergosterol, de acordo com resultados da literatura, ao passo que a fitoceramida a baixas concentrações tem a capacidade de induzir a formação de fases gel de elevada rigidez. Neste trabalho é proposto um diagrama de fases do tipo peritéctico para o sistema POPC/fitoceramida (C18:0),com extensas regiões de coexistência de fases gel/fluido. Concluiu-se também que o t-PnA e util para identificar os domínios ricos em fitoceramida, mas o DPH não consegue detectar alterações biofísicas entre os modelos com ergosterol e fitoceramida. Assim, para além destas sondas foi utilizada a sonda 4,4-AminoNafetilEtenilPiridínio sensível ao potencial (Di-4- ANEPPS) pertencente a uma família de sondas cujas propriedades de fluorescência são reconhecidamente sensíveis à presença de colesterol. Foram analisados comparativamente os sistemas binários de 1,2-Dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), POPC e palmitoil-esfingomielina (PSM) com colesterol, ergosterol e fitoceramida. Os resultados obtidos mostram que a sonda tem uma resposta fotofísica adequada (desvios para o azul no espectro de emissão e aumento dos tempos de vida de fluorescencia) para identificar fases ricas quer em colesterol, quer em ergosterol, e uma vez que não é sensível a presença de fitoceramida, permitirá em estudos posteriores distinguir domínios ricos nesta de domínios ricos naqueles.
Different domains have been identified in the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae, which are ergosterol and/or sphingolipid-enriched, and may be organized in a liquid ordered (lo)-like phase. However, the biophysical principles underlying the formation and function of those domains are not fully understood. In the present work, fluorescence spectroscopic techniques, both steady-state and time-resolved, were used to characterize the biophysical properties of several lipid mixtures mimicking yeast plasma membrane domains, in order to understand those principles. The binary systems 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)/ ergosterol and POPC/ phytoceramide, that mimic the role of sterols and sphingolipids in domain formation, respectively, were studied with the probes trans-parinaric acid (t-PnA) and diphenyl-hexatriene (DPH). The formation of a lo phase induced by ergosterol was confirmed, in agreement with the literature, whereas phytoceramide at low concentrations is able to induce the formation of a highly rigid gel phase. In this work, a peritectic phase diagram is proposed to describe the behaviour of the POPC/phytoceramide (C18:0) system. The diagram displays extensive gel/fluid coexistence regions. It was also concluded that t-PnA is useful to identify phytoceramideenriched domains. However, DPH is unable to distinguish biophysical properties of ergosterol and phytoceramide containing model systems. Thus, in addition to those probes, the probe (4,4-AminoNaphthylEthenylPyridinium) Di-4-ANEPPS was also used, because it belongs to a family of probes recognizably sensitive to cholesterol. The binary systems 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), POPC and palmitoyl-sphingomyelin (PSM) with cholesterol, ergosterol and phytoceramide. The results obtained show that the probe has a proper photophysical response (blue-shifts of the emission spectra and increase of fluorescence lifetimes) for identifying phases that are cholesterol- and ergosterol-enriched. Once that the probe is insensitive to the presence of phytoceramide, it will allow in future studies to distinguish domains formed by the former from those formed by the latter.
