Identification of RNA regulators operating in the segmentation clock

• Autor(es): Fernandes, Sara Maria Ferreira, 1987-
• Data: 2011
• Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/8734
• Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
• Assunto(s): Bioquímica; Teses de mestrado - 2011
• Tipo de Documento: Dissertação de mestrado
• Idioma: Inglês
• Orientador(es): Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-; Saúde, Leonor
• Contribuidor(es): Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011

O desenvolvimento embrionário e rigorosamente controlado no tempo e no espaço, sendo que, grande parte dos processos envolvidos neste controlo depende de mecanismos de regulação postranscripcional, especificamente, da modulação da estabilidade do mRNA e da sua eficiência de tradução. A somitogenese, em particular, e um processo que ocorre no desenvolvimento embrionário de vertebrados e consiste na formação de estruturas transientes a partir da mesoderme pre-somitica, denominadas somitos, sendo que estes actuam como precursores de estruturas repetitivas, incluindo as vertebras, costelas, musculo esquelético e a derme das costas. A formação dos somitos dá-se de forma sequencial e rítmica, sendo este controlo espacial e temporal exercido por dois mecanismos: um relógio molecular, constituído por genes com expressão cíclica; e uma frente de diferenciação (wavefront) formada por um gradiente morfogénico. Modelos matemáticos demonstraram que as oscilações de expressão genica potenciadas por este relógio molecular só se observam se estes genes derem origem a mRNAs instáveis. Paralelamente, o gradiente morfogénico associado a wavefront e estabelecido pela lenta degradação do mRNA de um dos morfogeneos - o fgf8. Consequentemente, a somitogenese e fortemente depende da regulação da estabilidade dos mRNAs dos genes cíclicos e da wavefront, no entanto os mecanismos moleculares envolvidos nestes processos de regulação pos-transcripcional não foram ate data elucidados. De forma a desvendar os mecanismos envolvidos na regulação da estabilidade do mRNA destes genes, começamos por proceder ao estudo do efeito que as regiões não traduzidas a 3' ( 3'UTRs ) dos genes cíclicos e da wavefront do peixe zebra, tem na expressão de um sistema repórter. Também construímos um modelo matemático descritivo deste sistema repórter com o intuito de caracterizar a estratégia experimental implementada. Numa segunda abordagem, foi realizada uma análise bioinformática das sequências das 3'UTRs destes genes focada na identificação de elementos regulatórios que possam estar envolvidos na modulação dos efeitos observados. A análise das sequências não traduzidas, disponíveis nas bases dados, revelou a existência de três 3'UTRs alternativas para o gene da wavefront do peixe zebra fgf8a. Estas 3'UTRs alternativas são produzidas como resultado da utilização diferencial de três sinais de poliadenilacao alternativos. A influência destas fgf8a 3'UTRs e das 3'UTRs dos genes cíclicos her1 e her7 na expressão do mRNA foi testada in vivo. O procedimento experimental envolveu o estabelecimento de um sistema repórter in vivo, em particular a produção, in vitro, de mRNAs repórter contendo a sequência codificante de proteína fluorescente (Green Fluorescent Protein) acoplada as sequências 3'UTRs dos genes dos genes de interesse. Estes mRNAs repórter foram microinjectados em embriões de peixe zebra no estádio de uma célula e a análise dos níveis de expressão do repórter foi feita 25 a 33 horas apos injeccao. Esta análise permitiu a observação da redução da expressão do repórter associada a duas das 3'UTRs alternativas de fgf8a em relação aos controlos, no entanto, interpretação dos resultados obtidos para a terceira 3'UTR de fgf8a necessita de uma otimização adicional do sistema experimental. Relativamente aos genes cíclicos, observamos que as 3'UTRs de her1 e her7 provocam uma regulação negativa da expressão do repórter. Estes resultados sugerem que a destabilização dos mRNAs de her1 e her7 pode ser mediada por elementos nas suas 3'UTRs. Esta sugestão foi apoiada pelo nosso modelo matemático, representativo do sistema experimental, e o processamento do transcrito foi simulado em diferentes condições de estabilidade e eficiência de tradução do mRNA. A informação obtida com esta caracterização, juntamente com a dinâmica de expressão observada in vivo num período de 8 horas, sugere que os efeitos das 3’UTRs na expressão do gene repórter in vivo resultam de mecanismos de regulação negativa da estabilidade do mRNA. No entanto, são necessários estudos adicionais para avaliar um possível envolvimento destas 3'UTRs no controlo da tradução dos mRNAs. A implementação deste sistema experimental conduziu a observação de uma influência diferencial do método de poliadenilacao do mRNA repórter na sua expressão in vivo, sendo esta influencia especialmente marcante para o repórter fluorescente sem 3’UTRs. Este repórter, quando e poliadenilado in vitro, produz níveis de expressão reduzidos. No entanto, se um sinal de poliadenilacao for utilizado a sua expressão e favorecida. Uma explicação possível para este fenómeno pode residir no facto de o sinal de poliadenilacao utilizado actuar como uma sequencia separadora entre o codão de terminação e a cauda poly(A), que não esta presente no transcrito poliadenilado in vitro. A necessidade desta sequência separadora para o processamento normal do mRNA foi previamente considerada na literatura. Neste estudo, propomos a hipótese de que na ausência deste separador, a terminação da tradução não se processa correctamente e consequentemente o mRNA e reconhecido pela maquinaria de controlo de qualidade celular como um transcrito anormal, sendo degradado com uma eficiência acentuada. Utilizando uma abordagem bioinformática, procedemos a identificação de elementos reguladores que poderiam mediar efeito que as 3'UTRs dos genes cíclicos e da wavefront exercem na expressão de um repórter. Nesta abordagem bioinformática tivemos em conta uma teoria actual que considera que a instabilidade dos vários mRNAs cíclicos poderia ser regulada por uma plataforma postranscripcional comum, sendo que esta plataforma poderia incluir microRNAs, proteínas de ligação ao RNA, ou ambos. Neste cenário, os constituintes da plataforma iriam interagir com elementos ou motivos de sequência presentes nas regiões não traduzidas (5'UTRs e 3'UTRs) dos genes cíclicos potenciando a sua degradação coordenada. Neste estudo, previmos a existência de 3'UTRs alternativas para dois genes ortologos do fgf8a de peixe zebra utilizando duas ferramentas online de previsão de locais de poliadenilacao, polyAH e polyApred. A subsequente identificação de elementos de sequência conservados entre diferentes espécies de vertebrados foi feita recorrendo ao alinhamento de sequências relevantes. Esta análise revelou um elemento fortemente conservado entre as 3'UTRs de fgf8a do peixe zebra e as dos seus ortologos de galinha e murino. Uma subsequente pesquisa unbiased de motivos nas 3’UTRs de interesse revelou a presença que um motivo TC-rich nas 3'UTRs de vários genes da família her, do peixe zebra, incluindo os genes cíclicos, her1 e her7,Este motivo também foi identificado nas 3'UTRs de genes cíclicos de galinha e murino. Numa abordagem focada na identificação de potenciais factores de regulação, procedemos a previsão de locais de ligação de proteínas reguladoras (RNA-binding proteins) e microRNAs nas 3'UTRs dos genes cíclicos e do fgf8a do peixe zebra. Para tal recorremos as ferramentas SplicingRanibow, microInspector e MicroCosm. Nas 3'UTRs de todos os genes cíclicos e da wavefront do peixe zebra foram previstos motivos de ligação a membros da família hnRNP. Adicionalmente, nas 3'UTRs de dois genes cíclicos - her7 e delta - identificamos motivos de ligação a membros da família miR-1 de microRNAs e a membros dos clusters de microRNAs miR-17~92. Note-se que estes microRNAs e proteínas têm funções documentadas no desenvolvimento embrionário. Adicionalmente, os padrões de expressão destes microRNAs e RNA-binding proteins durante o desenvolvimento embrionário do peixe zebra, documentados na literatura, revelam que estes são expressos durante a somitogenese, em estruturas do embrião onde os seus alvos previstos são transcritos e exercem a sua função. Consequentemente, os microRNAs e RNA-binding proteins identificados neste estudo constituem excelentes candidatos para a regulação postranscipcional dos genes cíclicos e da wavefront. O sistema experimental implementado in vivo para a realização deste estudo, poderá ser utilizado em abordagens futuras para determinar a influência que cada um dos elementos identificados bioinformaticamente, tem na regulação da estabilidade e eficiência de tradução dos seus respectivos mRNAs.

Embryonic development is highly controlled in space and time and in many developmental processes this control relies on mechanisms of post-transcriptional regulation, namely the modulation of mRNA stability and translation efficiency. This study is focused on the formation of transient mesodermal structures, termed somites, which are the precursors of the vertebrae, skeletal muscles and dermis of the back. Somite formation – Somitogenesis - is governed by two mechanisms: a molecular clock, composed of cyclically expressed genes that need to be unstable at the mRNA level to produce sustained oscillations; and a wavefront of differentiation, formed by a morphogen gradient which is thought to be generated by the slow degradation of the morphogens' mRNA. However, the mechanisms that regulate the stability of these mRNAs have not been studied. We set out to assess the effects that the 3'untranslated regions (3'UTRs) of the zebrafish cyclic and wavefront genes exert on the stability and translation efficiency of their mRNAs. To achieve this we established an in vivo fluorescent reporter system and created a mathematical model to describe and characterize this system. Additionally we conducted a bioinformatic identification of sequence elements present in these UTRs that could modulate the observed effects. We uncovered the existence of three alternative 3'UTRs for the wavefront gene fgf8a. Our in vivo studies revealed that two of these fgf8a alternative 3'UTRs, as well as the 3'UTRs of the cyclic genes her1 and her7, modulate a negative regulation of the reporters' expression. The bioinformatic approach revealed inter-species conserved sequence elements in these 3'UTRs, as well as predicted binding motifs for heterogeneous ribonucleoproteins, and for members of the microRNA-1 family and microRNA 17~19 clusters. The in vivo experimental system implemented will enable the future study of the role these sequence elements play in the post-transcriptional regulation of the cyclic and wavefront genes.