Autor(es): Torcato, Inês Mota
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/8915
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Péptidos antimicrobianos; Membranas; Resistência bacteriana; Antibióticos; Substituição de resíduos de aminoácidos; Teses de mestrado - 2011
Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2011
O aumento das resistências bacterianas aos antibióticos correntes, torna necessário o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. Os péptidos antimicrobianos (AMPs) ao fazerem parte do sistema imunitário inato de humanos e ao possuírem um extenso espectro de acção contra bactérias e vírus, são uma alternativa promissora. Para além disso, por substituição de resíduos de aminoácidos a sua actividade, especificidade e citotoxicidade podem ser optimizadas. O BP100 é um AMP híbrido de cecropina A e melitina com actividade comprovada contra bactérias Gram-negativas, mas não contra bactérias Gram-positivas. Com o intuito de aumentar a actividade antimicrobiana deste tipo de péptidos foram desenvolvidos e sintetizados dois derivados, PepRYL e PepRWL, por introdução de resíduos de arginina e triptofano. Para comparar a actividade destes derivados com a de AMPs já estudados, todos os ensaios foram também estudados os péptidos BP100 e Sub3, sendo o Sub3 um AMP activo contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Por determinação da concentração miníma inibitória (MIC) observou-se actividade antimicrobiana destes derivados a concentrações na ordem do micromolar contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, à semelhança do que foi também observado em ensaios de microscopia de força atómica, onde a baixas concentrações destes péptido era observável a perturbação das membranas bacterianas. Por realização de estudos de espectroscopia de fluorescência e de dicroísmo circular observou-se que ambos os derivados apresentam preferência para vesículas aniónicas, sendo observada uma alteração estrutural por interacção péptido-vesículas aniónicas. Em todos os ensaios de caracterização da interacção do péptido com a membrana foi possível inferir a existência de um mecanismo de acção diferente para o Sub3. De uma forma geral, PepRYL e PepRWL possuem uma maior actividade antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas que o BP100. Para além disso, PepRWL e PepRYL possuem actividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas enquanto que o BP100 é inactivo.
The increasing resistance of bacteria to conventional antibiotics has led to the need for alternative therapies. Being part of the human innate defense system, antimicrobial peptides (AMPs) are a very promising alternative, presenting a broad spectrum of activity against bacteria and viruses. Designing superior AMPs through amino acid residues substitution is a powerful strategy to enhance their activity and specificity but also to decrease their cytotoxicity. BP100 is a cecropin A–melittin hybrid peptide that has proved bactericidal activity against Gram-negative bacteria but not against Gram-positive. Knowing that arginine and tryptophan amino acid residues enhance antimicrobial activity, we designed and sinthesized BP100 analogues, PepRYL and PepRWL, that include these residues, in an attempt to improve antimicrobial activity. The activity of the novel peptides was compared with the activity of BP100 and Sub3, an AMP with activity against both Gram-negative and Gram-positive bacteria. PepRYL and PepRWL have bactericidal activity at low micromolar range against Gram-negative and Gram-positive bacteria as revealed with minimal inhibitory concentration (MIC) assays. Antimicrobial activity of PepRYL and PepRWL was further confirmed by atomic force microscopy imaging in which bacterial membrane perturbation is shown. To clarify the peptides’ mechanism of action and structure in aqueous and lipid environments, fluorescence spectroscopy and circular dichroism measurements were employed. A preference of both BP100 derivatives towards anionic vesicles over neutral vesicles was observed. Accordingly, a conformational change was observed in both PepRYL and PepRWL peptides structure upon interaction with negatively-charged lipidic vesicles. Peptide-membrane studies suggested that Sub3 has a mechanism of action distinct from BP100 and its analogues. Overall, BP100 derivatives have a higher antimicrobial activity against Gram-negative bacteria than BP100 and show high activity towards Gram-positive bacteria, unlike other cecropin A–melittin derivatives. Moreover, PepRWL is more efficient than Sub3 against Gram-positive bacteria.
