Cellular immune response to experimental infections with mycobacteria with different degrees of virulence: development of new preventive strategies

• Autor(es): Torrado, Egídio
• Data: 2007
• Identificador Persistente: https://hdl.handle.net/1822/7083
• Origem: RepositóriUM - Universidade do Minho
• Projeto/bolsa: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/POCI-2010/SFRH%2FBD%2F9757%2F2003/PT
• Assunto(s): 616.5
• Tipo de Documento: Tese de doutoramento
• Idioma: Inglês
• Orientador(es): Pedrosa, Jorge
• Contribuidor(es): Universidade do Minho

Descrição

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde – Ciências Biológicas e Biomédicas.

Mycobacterium ulcerans is the etiological agent of Buruli ulcer (BU), a serious tropical, necrotizing skin disease that can cause terrible deformities and disabilities if not treated at early stages. This pathogen was first identified in 1948 by MacCallum and colleagues in Australia; however, until the last decade, BU has received little attention from the scientific community. BU affects mainly rural and poor communities in Africa. Different control measures have been suggested, however, associated with BU, there is a strong social stigma, and BU is often seen as a curse rather than a disease. Thus, the development of a specific vaccine would be the most satisfactory strategy to control BU. It is therefore critical to advance the knowledge on the host/parasite interactions concerning this enigmatic disease. The pathology of BU is closely associated with mycolactone, a polyketide exotoxin produced by M. ulcerans and which is the major virulence factor of the agent of BU. It is known that cell wall-associated mycolactone or free toxin that diffuses across the tissues, induces apoptosis and necrosis of cells, and, ultimately, the formation of ulcers. Indeed, tissue necrosis and extracellular clumps of M. ulcerans bacilli are the histopathological hallmark of BU. The extensiveness of necrotic areas devoid of cells, which expand, possibly due to mycolactone diffusion, beyond areas where M. ulcerans bacilli can be found, has lead to the assumption that M. ulcerans induces low or absent cellular inflammatory responses. Additionally, the presence of large clumps of free bacteria in the central acellular areas directed early investigators to classify M. ulcerans as an extracellular pathogen, an exception among pathogenic mycobacteria. In contrast, many reports have described the occurrence of cell-mediated immunity (CMI) and delayed-type hypersensitivity (DTH) responses in BU patients, strongly suggesting that macrophages play an effector role in the control of infection. The use of an animal model of infection, in which it is possible to analyze the entire lesion at very early time points, is essential to understand the interaction of M. ulcerans with the host immune cells, particularly phagocytes. Previous work from our laboratory in the mouse footpad model of infection has shown that inoculation of M. ulcerans in the subcutaneous tissue induces an inflammatory cellular response with the involvement of macrophages and neutrophils. Moreover, our group has shown that even in advanced lesions, inflammatory cells are consistently present, although restricted to the periphery of the necrotic infectious center. The constant availability of phagocytes to interact with M. ulcerans, at the persistent areas of inflammatory cellular infiltration, directed me to reevaluate the interaction of this pathogenic mycobacterium with the host macrophages, in the context of my PhD thesis, both in human and in experimental infections. In experimental murine infections, we showed that M. ulcerans bacilli were phagocytosed in the subcutaneous tissue early after infection. At later time points, as previously described, we found free M. ulcerans organisms concentrated in central necrotic acellular areas. Surrounding these necrotic areas, where inflammatory infiltrates could be seen, M. ulcerans bacilli were however found mainly within macrophages. A histological evaluation of serial sections of BU tissue samples from 15 African patients with inflammatory infiltrates, confirmed the occurrence in 8 patients of intracellular bacilli within phagocytes infiltrating the peripheral areas. In vitro, at low multiplicities of infection (MOI), we found that M. ulcerans was efficiently phagocytosed by macrophages, at similar rates as those for the intracellular pathogens Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG. Within macrophages, M. ulcerans was found surrounded by the phagosomal membrane in tight or spacious phagosomes. We also demonstrated that both virulent, mycolactone-producing, as well as mutant, nonproducing strains grew inside cultured macrophages when low MOIs were used to prevent mycolactoneassociated cytotoxicity. After this initial phase of intracellular residence and proliferation, mycolactone-producing strains were found to lyse the macrophage, becoming extracellular. These results suggest that M. ulcerans is an intracellular pathogen like the other virulent mycobacteria, which explains the reported occurrence of CMI and DTH in model and human cases of M. ulcerans infection. Following the demonstration of an intramacrophage growth phase for the agent of BU, our work focused on the role played by cytokines that are associated with the host resistance to intracellular pathogens. Tumor necrosis factor (TNF) and interferon-gamma (IFN-γ) are two cytokines with a key role in the activation of macrophages, required to the control of intracellular mycobacteria. A previous report showed that a lipidic fraction of M. ulcerans culture filtrates containing mycolactone suppressed the production of TNF by cultured human monocytes. On the other hand, the expression of TNF has been reported in BU lesions. Therefore, we considered pertinent to study the effect of the infection with different strains of M. ulcerans on the production of this cytokine by macrophages, as well as to assess in vivo the role played by TNF in infections by M. ulcerans. We confirmed previous observations of other authors by showing that mycolactone inhibits TNF production, in a dose-dependent manner, and we have expanded these observations by using a model of primary mouse macrophages infected with live M. ulcerans bacilli producing different types of mycolactone and displaying different degrees of virulence. Our work shows that macrophages infected with highly virulent M. ulcerans produce much lower levels of TNF, as compared with macrophages infected with intermediate or nonvirulent strains. The reduced production of TNF, including at low MOIs, was not due to an early death of infected macrophages, since the production of the inflammatory chemokine macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) was not inhibited in macrophages infected with the highly virulent strain. Finally, we showed that TNF induced during M. ulcerans infection plays a protective role, since TNF-p55-defficient mice were more susceptible to nonvirulent and intermediate virulent strains of M. ulcerans when compared to wild-type mice . IFN-γ is a key cytokine in the activation of the macrophage’s microbicidal mechanisms required for the control of intracellular pathogens. We showed that IFN-γ-deficient mice displayed an increased susceptibility to infection by nonvirulent and intermediate virulent strains of M. ulcerans, but not to a highly virulent strain. In vitro, IFN-γ-activated macrophages control the proliferation of the nonvirulent strain as well as the intermediate virulent strain at a low MOI. For the nonvirulent strain, the intramacrophage mechanism of control was nitric oxide (NO) dependent, since with the inhibition of NO production, macrophages were no longer able to control the proliferation of this strain. Contrarily, NO production was not detected in macrophages infected with intermediate and highly virulent strains. However, macrophages infected with the intermediate virulent, as well as with the nonvirulent strain, expressed LRG-47, being this indicative of phagosome maturation. In summary, we have shown that M. ulcerans, like the other pathogenic mycobacteria, has a phase of intramacrophage residence and multiplication. Additionally, we demonstrated that M. ulcerans induces the production of TNF by infected macrophages and that this cytokine plays a protective role in experimental BU; however, mycolactone, the toxin produced by M. ulcerans, inhibits the production of this cytokine. We also demonstrate that IFN-γ is required to the induction of NO and phagosome maturation which are the macrophage’s microbicidal mechanisms required to control intracellularly M. ulcerans proliferation. Taken together, the results here presented are in accordance with the data in the literature showing that resistance to M. ulcerans infections are associated with CMI and DTH. The peculiarity of the immunology of M. ulcerans infections lies in the association of the mycobacterial nature of this microorganism with its unique capacity to secrete a potent cytotoxic exotoxin which influences CMI. These findings have potential relevance for the development of a vaccine against BU targeting cellular immune mechanisms associated with the activation of the macrophage effector functions.

A bactéria Mycobacterium ulcerans é o agente etiológico da úlcera do Buruli (BU), uma doença tropical necrotizante que afecta a pele, causando deformidades terríveis se não for tratada numa fase precoce. Este agente patogénico foi identificado pela primeira vez por MacCallum et al. em 1948 na Austrália; no entanto, até à última década, a BU passou, praticamente, despercebida à comunidade científica. A BU afecta essencialmente comunidades rurais, pobres, de Africa. Diferentes medidas têm sido sugeridas para controlar a BU, no entanto, associado a esta doença existe um estigma social muito forte, sendo que, frequentemente, a BU é vista como uma maldição e não como uma doença. Assim sendo, o desenvolvimento de uma vacina contra a BU seria a estratégia mais adequada para a controlar a doença. Para tal, é essencial aumentar o reduzido conhecimento existente, no que respeita à interacção hospedeiro/agente infeccioso. A patologia da BU está intimamente associada com a micolactona, uma exotoxina produzida pelo M. ulcerans, sendo este o factor de virulência mais importante do agente da BU. É sabido que a micolactona associada à parede celular, ou livre, que se difunde pelos tecidos, induz apoptose e necrose das células do hospedeiro, levando à formação de úlceras. De facto, a necrose dos tecidos e a localização extracelular do M. ulcerans são as características histopatológicas distintivas da BU. A extensão das lesões necróticas desprovidas de células que, possivelmente devido à difusão da toxina, se expandem para além das áreas onde o bacilo se encontra, levou à interpretação que o M. ulcerans induzia respostas inflamatórias celulares reduzidas ou ausentes. Adicionalmente, a presença de grumos de bacilos livres na área central, acelular, do foco da infecção, levou à caracterização do M. ulcerans como uma micobactéria extracelular, uma excepção entre o grupo das micobactérias patogénicas. No entanto, diversos estudos descreveram a ocorrência de imunidade mediada por células (CMI), assim como de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH), em doentes com BU, o que sugere um papel efector do macrófago no controlo desta infecção. A utilização de um modelo animal de infecção, que possibilite a análise completa da lesão em tempos precoces, é essencial para que seja possível entender a interacção de M. ulcerans com as células do sistema imunológico, nomeadamente com os fagócitos. Trabalho prévio do nosso laboratório mostrou que, no modelo murino de infecção da almofada plantar, a infecção subcutânea com M. ulcerans induz uma resposta inflamatória celular com a presença de macrófagos e neutrófilos. Adicionalmente, o nosso grupo mostrou que, mesmo em estadios avançados da lesão, as células inflamatórias se encontravam constantemente presentes na lesão, restritas, no entanto, à periferia do centro necrótico acelular. A constante disponibilidade de fagócitos para interagir com o M. ulcerans, nas zonas de infiltrado à periferia da lesão, direccionou o meu trabalho de doutoramento no sentido de reavaliar a interacção deste agente patogénico com os fagócitos do hospedeiro, quer em lesões humanas, quer em infecções experimentais. Em infecções experimentais no modelo murino, mostrámos que o M. ulcerans era fagocitado no tecido subcutâneo em tempos curtos após a infecção. Mais tardiamente, conforme anteriormente descrito, o M. ulcerans encontrava-se essencialmente na área necrótica, acelular da lesão. À periferia desta área central necrótica, e nos locais onde encontrava o infiltrado inflamatório, o M. ulcerans era observado essencialmente no interior de macrófagos. A análise histopatológica de cortes seriados de 15 amostras de lesões de BU, contendo infiltrados inflamatórios e colhidas de doentes Africanos, confirmou, em 8 amostras, a localização intracelular do bacilo em fagócitos presentes nas áreas periféricas da lesão. In vitro, a baixas multiplicidades de infecção (MOI), mostrámos que o M. ulcerans é eficientemente fagocitado por macrófagos, a níveis similares aos encontrados para o Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium bovis BCG. No interior dos macrófagos, o M. ulcerans foi encontrado rodeado pela membrana do fagossoma. Mostrámos, também, que, quer estirpes virulentas, produtoras de micolactona, quer estirpes mutantes, deficientes em micolactona, crescem dentro de macrófagos, quando baixas MOIs são usadas, prevenindo-se, assim, a citotoxicidade associada à produção de micolactona. Após esta fase inicial de residência e multiplicação intracelular, as estirpes produtoras de micolactona provocam a lise dos macrófagos, tornando-se extracelulares. Estes resultados sugerem que o M. ulcerans é um agente patogénico intracelular, tal como as outras micobactérias patogénicas, o que explica a ocorrência de CMI e DTH, descritas em infecções humanas e em infecções experimentais. Após a demonstração da existência de uma fase intracelular no ciclo de vida de M. ulcerans, o trabalho focou-se no papel das citocinas que estão associadas à resistência do hospedeiro a agentes patogénicos intracelulares. O factor de necrose tumoral (TNF) e interferão-gama (IFN-γ) são duas citocinas com um papel chave na activação dos mecanismos microbicidas do macrófago, necessários para o controlo intracelular das micobactérias. Resultados anteriormente publicados mostram que uma fracção lipídica, contendo micolactona, suprime a produção de TNF por monócitos humanos cultivados in vitro. No entanto, a expressão de TNF foi reportada em lesões humanas da BU. Tendo estes aspectos em consideração, considerou-se pertinente estudar o efeito da infecção, por diferentes estirpes de M. ulcerans, na produção desta citocina por macrófagos infectados, assim como a relevância biológica do TNF em infecções por M. ulcerans. O nosso trabalho confirmou resultados previamente publicados, mostrando que a micolactona inibe a produção de TNF, de uma forma dependente da dose, e expandiu essas observações, usando um modelo de macrófagos primários infectados com estirpes de M. ulcerans que produzem diferentes tipos de micolactona e que apresentam diferentes níveis de virulência. Verificámos, de facto, que macrófagos infectados com estirpes virulentas de M. ulcerans produzem menores quantidades de TNF, comparativamente com macrófagos infectados com estirpes avirulentas ou de virulência intermédia. A reduzida produção de TNF, incluindo a baixas MOIs, não se deveu a uma morte prematura dos macrófagos infectados, uma vez que e a produção de proteína inflamatória de macrófagos-2 (MIP-2) não era inibida pelas estirpes virulentas. Finalmente, mostrámos que o TNF induzido após infecção tem um papel protector, uma vez que ratinhos deficientes no receptor P55 do TNF são mais susceptíveis à infecção por estirpes de M. ulcerans avirulentas ou de virulência intermédia, quando comparados com ratinhos selvagem. O IFN-γ é uma citocina chave na activação dos mecanismos microbicidas do macrófago, necessários para o controlo da proliferação de agentes patogénicos intracelulares. Neste trabalho, mostrámos que ratinhos deficientes na produção de IFN-γ são mais susceptíveis à infecção por estirpes de M. ulcerans avirulentas ou de virulência intermédia, o mesmo não se verificando com uma estirpe de elevada virulência. In vitro, verificámos que macrófagos activados com IFN-γ controlam a proliferação de estirpes de M. ulcerans avirulentas e, também, de virulência intermédia, quando foi testada uma baixa MOI. Para a estirpe avirulenta, os mecanismos de controlo intramacrofágico mostraram ser dependentes da produção de óxido nítrico (NO), uma vez que, inibindo-se a produção de NO, os macrófagos activados deixam de controlar a sua proliferação. Contrariamente à infecção pela estirpe avirulenta, a produção de NO não foi detectada para as outras estirpes testadas. No entanto, macrófagos infectados com a estirpe de M. ulcerans de virulência intermédia expressavam LRG-47, o que sugere a ocorrência de maturação do fagossoma. Em resumo, mostrámos que o M. ulcerans, tal como as outras micobactérias patogénicas, tem uma fase de residência e multiplicação intracelular. Mostrámos, também, que o M. ulcerans induz a produção de TNF por macrófagos infectados, tendo esta citocina um papel chave na resposta protectora contra infecções experimentais por M. ulcerans; no entanto, a micolactona, a toxina produzida por M. ulcerans, inibe a produção desta citocina. Demonstrámos ainda, que o IFN-γ é necessário para a indução da produção de NO e para a maturação do fagosoma, sendo estes os mecanismos microbicidas necessários para controlar a proliferação intramacrofágica de M. ulcerans. No seu conjunto, os resultados aqui apresentados estão em acordo com resultados previamente publicados que mostram que a resistência à infecção por M. ulcerans está associada com CMI e DTH. A peculiaridade da resposta imune ao M. ulcerans encontra-se na associação entre a natureza micobacteriana deste microorganismo e a sua capacidade de produzir uma exotoxina citotóxica, influenciando assim a resposta imune celular. Estes resultados têm uma relevância potencial para o desenvolvimento de uma vacina contra a BU, tendo como alvo mecanismos imunes mediados por células, associados com a activação dos mecanismos efectores do macrófago.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/9757/2003.