Stabilization of COMT by experimental design approaches

• Autor(es): Oliveira, Diana Margarida Tavares de
• Data: 2014
• Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10400.6/2944
• Origem: uBibliorum
• Assunto(s): COMT; Membrane Protein; Pichia pastoris; Protein Stabilization; Protein Stabilization
• Tipo de Documento: Dissertação de mestrado
• Idioma: Inglês
• Orientador(es): Passarinha, Luís António Paulino; Pedro, Augusto Quaresma Henriques
• Contribuidor(es): uBibliorum

Descrição

Catechol-O-methyltransferase (COMT) is monomeric enzyme magnesium dependent that is involved in the inactivation of catechol substrates such as dopamine, epinephrine and norepinephrine. The COMT enzyme is present as two isoforms, a soluble isoform (SCOMT) that is found in the cytoplasm and a membrane-bound isoform (MBCOMT) which is present mainly in the rough endoplasmatic reticulum membrane. Both isoforms are extremely thermolabile and, except for catechol estrogens, which possess similar KM values for both isoforms, MBCOMT presents higher affinity (lower KM) for the catechol substrates. In the last years, these enzymes have been described as being involved in several human diseases such as catechol-estrogen induced cancers, cardiovascular diseases and degenerative brain disorders. Actually, the most effective treatment for Parkinson’s disease is a triple prophylaxis consisting of the dopamine replacement with levodopa together with an inhibitor of aromatic amino acid decarboxylase and an inhibitor of COMT. Since both COMT isoforms are present in tissues at low concentrations, in order to accomplish its structural or functional characterization, these enzymes are usually expressed in a recombinant form using a suitable host, in which the final aim is the achievement of protein extracts with enough quantity and purity, enabling structural and functional studies. Specifically, in this work, it was intended to establish a formulation that allows the storage of recombinant and biologically active MBCOMT in a native state from Pichia pastoris lysates. Therefore, it was applied a design of experiments (DOE) in order to obtain the optimum conditions for MBCOMT storage according to the stabilizers concentrations (trehalose, glycerol and cysteine), the storage temperature (-80 ºC, -20 ºC and 4 ºC) and the storage time (24, 48 and 72 hours). The global aim of this work was to establish the optimum storage conditions that allow MBCOMT to maintain its biological activity in a native state for as long as possible without compromising its biological activity. Thus, in order to achieve this aim, an artificial neural network was created where by the analysis of the response surface graphics, a specific run (optimum point) was obtained where the percentage of the MBCOMT biological activity recovery was the highest (114.56 %). Therefore, a specific formulation with 100 mM trehalose, 30 % (v/v) glycerol and 150 mM cysteine allow MBCOMT stabilization during 72 hours at 4 ºC, as judged by the slightly improvement in MBCOMT biological activity at 72 hours, when compared with the MBCOMT biological activity obtained immediately after cell lysis (0 hours). In conclusion, for the first time, a systematic study was carried out in order to evaluate the best conditions to storage recombinant MBCOMT, allowing to obtain a specific formulation that maintain MBCOMT in a native and biologically active state during 72 hours.

A catecol-O-metiltransferase (COMT) é uma enzima monomérica dependente de magnésio envolvida na inativação de substratos com estrutura catecólica como a dopamina, epinefrina e norepinefrina. A COMT apresenta-se sob duas formas, uma isoforma solúvel (SCOMT) cuja localização é o citoplasma e uma isoforma membranar (MBCOMT) que se encontra predominantemente na membrana do retículo endoplasmático rugoso. Ambas as isoformas são extremamente termolábeis, sendo que a MBCOMT apresenta maior afinidade (menor KM) para todos os seus substratos, com exceção dos estrogénios com estrutura catecólica. Adicionalmente, tem sido descrito que estas enzimas possuem um papel importante em diversas patologias humanas tais como cancros induzidos por estrogénios, doenças cardiovasculares ou doenças neurodegenerativas. Atualmente, a terapêutica para a doença de Parkinson consiste numa tripla profilaxia incluindo levodopa, um inibidor da enzima descarboxilase dos aminoácidos aromáticos e um inibidor da COMT. Visto que ambas as isoformas são expressas em baixos níveis nos tecidos, para ser possível a sua caracterização estrutural ou funcional (que permita por exemplo, o desenvolvimentos de novos inibidores com potência e eficácia melhoradas), geralmente estas enzimas são expressas de forma recombinante utilizando um microrganismo adequado, tendo como objetivo final a obtenção de extratos proteicos em quantidade suficiente e pureza adequada que permita a realização dos estudos anteriormente mencionados. Em particular, neste trabalho, pretendeu-se estabelecer uma formulação que permita o armazenamento da MBCOMT recombinante no seu estado nativo e, consequentemente, com atividade biológica obtida a partir de lisados de Pichia pastoris. Sendo assim, foi aplicado um desenho experimental (DOE) de forma a poder encontrar as condições ótimas de armazenamento da MBCOMT em termos da concentração dos estabilizadores (trealose, glicerol e cisteína), temperatura (-80, -20 e 4ºC) e tempo de armazenamento (24, 48 e 72h). Com este trabalho pretendeu-se encontrar as condições ótimas de armazenamento que permitam manter a MBCOMT num estado nativo pelo máximo tempo possível sem comprometer a sua atividade biológica. Para alcançar este objetivo foi criada uma rede neuronal onde através da análise dos gráficos de resposta de superfície, foi-nos dado o ponto ótimo onde a percentagem de recuperação de atividade biológica da MBCOMT foi máxima (114.56 %). Assim sendo, uma formulação contendo 100 mM Trealose, 30 %(v/v) Glicerol e 150 mM Cisteína permitiu a estabilização da MBCOMT recombinante durante 72 horas a 4 ºC, como foi comprovado pelo ligeiro aumento na atividade biológica da MBCOMT às 72 horas, em comparação com os valores obtidos imediatamente após a lise celular (0 horas). Em conclusão, pela primeira vez efetuou-se um estudo sistemático acerca das melhores condições para o armazenamento da MBCOMT recombinante, permitindo obter uma formulação que mantém a MBCOMT num estado nativo e biologicamente ativo durante 72 horas.