Autor(es): Almeida, Ana Margarida Cardoso Valério de
Data: 2014
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10400.6/5628
Origem: uBibliorum
Assunto(s): Cromatografia de Afinidade; Desenho Experimental; Plasmídeo Hpv16-E6/E7 Superenrolado; Transfeção; Vacinas de Dna.; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências Biomédicas
A constante evolução da ciência tem permitido uma melhor partilha de conhecimentos na área da tecnologia do DNA recombinante, fornecendo um melhor conhecimento da informação contida nos genes e o impacto que alterações nesses genes poderão ter no organismo. A descodificação do genoma humano aliada ao progresso obtido no desenvolvimento de variados vetores de transporte de informação genética permitiu a evolução de terapias baseadas na entrega de genes terapêuticos, como a terapia génica e as vacinas de DNA. O desenvolvimento destas terapias trouxe uma nova esperança para o tratamento de certas patologias que, até então, permaneciam como intratáveis. Vetores biológicos e não biológicos têm evoluído largamente nos últimos anos, no entanto, a toxicidade demonstrada pela maioria dos vetores biológicos tem levado a um aumento de utilização de vetores não biológicos. O DNA plasmídico destaca-se entre os diversos vetores genéticos devido à simplicidade da sua produção, obtenção, baixo custo e ausência de toxicidade. As vantagens deste vetor têm levado a que a sua utilização como vacina de DNA tenha aumentado nos últimos anos, tornando-o o vetor de escolha na maioria dos estudos de investigação. As vacinas de DNA têm como modo de atuação a expressão de proteínas antigénicas com o objetivo de induzir uma resposta imunitária direcionada para essas mesmas proteínas, permitindo a prevenção e/ou tratamento de infeções virais e bacterianas. Torna-se imperativo o desenvolvimento de tecnologias que permitam a produção e purificação destes vetores, obtendo a maior percentagem de recuperação e pureza possíveis do plasmídeo na sua forma biologicamente ativa, a isoforma superenrolada (sc). A área da cromatografia tem progredido bastante no desenvolvimento de estratégias eficazes de purificação de plasmídeo, permitindo o aumento de produtividade e obtenção deste vetor e diminuindo eventuais custos associados à sua produção. O Vírus do Papiloma Humano (HPV) é um vírus sexualmente transmissível que se encontra atualmente associado ao desenvolvimento de massas tumorais devido à produção de duas proteínas oncogénicas, oncoproteínas E6 e E7, capazes de alterar o ciclo de proliferação celular e de provocar o crescimento anormal de células do organismo infetado. A tecnologia de vacinas de DNA apresenta-se assim como uma terapia promissora para infeções provocadas pelo HPV, através da indução de uma resposta imunitária contra as proteínas referidas. Recentemente, o nosso grupo de investigação conseguiu desenvolver de forma eficaz a produção e purificação da vacina de DNA sc HPV-16 E6/E7 através da utilização de um monolito modificado com ligandos de arginina, tirando partido dos princípios básicos da cromatografia de afinidade. Contudo, a recuperação do plasmídeo não foi a esperada, tendo sido apenas recuperado 39% da molécula alvo. O Desenho experimental é uma ferramenta estatística que, através da escolha correta dos fatores a serem avaliados, bem como os seus intervalos em estudo, permite a otimização de respostas de um sistema experimental. Deste modo, através do design experimental foi feita uma otimização ao sistema de purificação da vacina de DNA sc HPV-16 E6/E7 de modo a garantir um aumento de recuperação da molécula, mantendo o elevado nível de pureza. Com esse intuito, após uma avaliação inicial dos fatores e dos intervalos a serem usados, o design ‘Central Composite Face’ (CCF) foi utilizado para delinear um conjunto de experiências cromatográficas de modo a encontrar o ponto ótimo para a percentagem de recuperação do plasmídeo ser maximizada. A otimização foi bem-sucedida, permitindo a obtenção de uma percentagem de recuperação de cerca de 83%, mantendo-se a percentagem de 100% para a pureza. Após a otimização da estratégia de purificação, estudos de transfeção in vitro foram realizados de modo a avaliar a capacidade de transfeção celular e consequente expressão da proteína codificada pelo gene-alvo contido na vacina de DNA. Células CHO-1, isoladas a partir de tecido ovárico de rato chinês, foram cultivadas e transfetadas com a isoforma sc purificada através da estratégia otimizada com o monolito de arginina, bem como com a isoforma circular aberta (oc) e DNA plasmídico obtido através de um kit comercial, de modo a avaliar qual a melhor estratégia para transfeção. Através das técnicas de western blot e imunocitoquímica foi possível verificar que a entrada do pDNA nas células eucarióticas ocorreu com sucesso (processo de transfeção), observando-se um aumento significativo de expressão génica das proteínas E6 e E7 em comparação ao grupo de controlo (células não transfetadas). A avaliação da expressão génica da proteína E6 dos diferentes tipos de plasmídeos utilizados permitiu verificar que o aumento de expressão desta proteína foi mais significativo com a amostra de plasmídeo sc purificado pelo monolito de arginina, concluindo-se que de facto a isoforma sc induz uma maior eficiência de transfeção.
The infection by Human Papilloma Virus (HPV) is associated with the development of different tumours, in particular the cervical cancer. Oncoproteins E6 and E7, produced by this virus, are responsible for the disturbance of the cell cycle, through interaction with several proto-oncogenes, leading to uncontrolled proliferation of the infected host cells. Therefore, the development of a suitable therapy against HPV infection with these oncoproteins is a promising strategy. DNA vaccines arise as a potential therapeutic solution in cancer treatment, being able to trigger a strong immune response against the target antigen, normally expressed by the infected cells. The purification of supercoiled (sc) plasmid HPV16 E6/E7 DNA vaccine with the arginine monolith was recently developed by our research group. In spite of achieving 100% purity, only 39% of the target molecule was recovered. Experimental design is a new tool able to project several experiments, by evaluating and combining different factors, with the intent of improving and optimizing a given experiment. Through the use of Composite Central Face design and the choice of three factors to be evaluated, such as binding step, washing step and pH, different experiments were performed in order to achieve the optimal range for the sc HPV16 E6/E7 purity and recovery. The aim was successfully achieved with 83% of recovery and 100% of purity. Thereafter, transfection studies were performed in order to evaluate the plasmid DNA (pDNA) vaccine efficiency. Several plasmid samples obtained from different purification methods were tested: plasmid purified by a commercial kit, open circular isoform (oc) and sc isoform purified by our optimized strategy with the arginine monolith. After 72 hours of transfection, the expression of E6 protein in CHO-1 cells was evaluated through immunocytochemistry. Through immunofluorescence comparison, higher E6 protein expression was detected by sc pDNA, showing a significant increase, when compared to control group. On the other hand, pDNA purified with the commercial kit and oc pDNA had no significant immunofluorescence different in comparison with control group. These data suggest that the sc pDNA obtained by our optimized purification strategy is able to efficiently transfect cells and express the target proteins, encouraging us to proceed to in vivo studies in order to evaluate the immunogenicity of this DNA vaccine.
