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Lyophilization and a preliminary thermodynamic characterization of recombinant SCOMT_His6

Autor(es): Coval, Rúben Miguel Oliveira

Data: 2015

Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10400.6/6070

Origem: uBibliorum

Assunto(s): 5-Dinitrocatecol; Calorimetria de Titulação Isotérmica (Itc); Catecol-O-Metiltransferase; Doença de Parkinson; Liofilização; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia:: Outras Engenharias e Tecnologias; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia:: Outras Engenharias e Tecnologias; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia:: Outras Engenharias e Tecnologias


Descrição

Catechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.6) was first described in 1958. COMT is a monomeric enzyme magnesium dependent that is involved in the inactivation of catechol substrates such as dopamine, epinephrine and norepinephrine. COMT is an important target in protein engineering due to their role in normal brain and their possible role in human neurological disorders such as Parkinson's, schizophrenia, depression and Alzheimer's disease. Actually, the most effective treatment for Parkinson’s disease is a triple prophylaxis consisting of the dopamine replacement with levodopa together with an inhibitor of aromatic amino acid decarboxylase and an inhibitor of COMT. In recent years, several COMT inhibitors have been developed for Parkinson's disease treatment, and there is considerable interest in developing new and more effective inhibitors. To do so, two points should be taken into consideration. Firstly, although large quantities of COMT can nowadays be produced through biotechnological processes, is still difficult to maintain the protein in a stable and active state mainly in a more pure state, like that achieved after a chromatographic step. There is no fast way to get active protein unless all the process since the production or (in case of frozen cells) since the lyses was done. To overcome this limitation, in this work, a lyophilization process applied to a purified immobilized-metal affinity chromatograph (IMAC) COMT fraction was study with the objective to store or transporting this fractions more easily and for longer periods. The second aspect to take into account concerns the inhibitors of COMT produced. With the number of new inhibitors being produced, is important to study their interactions with the protein. The microcalorimetric technics appears as a good means to kinetically characterize these interactions. So, also in this work, is discussed an initially approach to establish an isothermal titration calorimetry (ITC) method to study interactions between the COMT enzyme and the 3,5-dinitrocatechol (3,5-DNC) inhibitor.

A proteína catecol-O-metiltransferase (COMT, CE 2.1.1.6) foi descrita pela primeira vez em 1958. A COMT é uma enzima monomérica, dependente de magnésio que está envolvida na inativação de substratos com estrutura catecólica como a dopamina, a epinefrina e a norepinefrina. A COMT é um alvo importante na engenharia de proteínas devido à sua função na atividade normal do cérebro e ao seu possível papel em desordens neurológicas humanas, como a doença de Parkinson, esquizofrenia, depressão e Alzheimer. Atualmente, o tratamento mais eficaz para a doença de Parkinson consiste numa tripla profilaxia que consiste na reposição de dopamina com levodopa, um inibidor da enzima descarboxilase dos aminoácidos aromáticos e um inibidor da COMT. Nos últimos anos têm vindo a ser desenvolvidos vários inibidores desta enzima para o tratamento da doença de Parkinson, e há um grande interesse em desenvolver novos inibidores mais eficazes. Para tal, dois pontos devem ser tidos em consideração. Em primeiro lugar, apesar de atualmente ser possível produzir grandes quantidades de COMT por processos biotecnológicos, ainda é difícil manter a proteína num estado estável e ativo, principalmente num estado mais puro, como aquele em que se encontra após um passo cromatográfico. Não há uma forma rápida de obter a proteína a menos que todo o processo desde a produção ou (no caso de células congeladas) desde a lise seja feito. Para ultrapassar essa limitação, neste trabalho, um processo de liofilização aplicado a uma fração purificada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) de COMT foi estudado com o objetivo de armazenar ou transportar estas frações mais facilmente e por períodos de tempo maiores. O segundo aspeto a ter em conta diz respeito aos inibidores produzidos para a COMT. Com o número de novos inibidores a serem produzidos, é importante estudar as suas interações com a proteína. As técnicas de microcalorimetria surgem então como um bom meio para caracterizar cineticamente essas interações. Portanto, também neste trabalho, é discutida uma abordagem inicial para estabelecer um método de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) para estudar as interações entre a enzima e o inibidor 3,5-dinitrocatecol (3,5-DNC).

Tipo de Documento Dissertação de mestrado
Idioma Inglês
Orientador(es) Passarinha, Luis António Paulino; Pedro, Augusto Quaresma Henriques
Contribuidor(es) Coval, Rúben Miguel Oliveira
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