Autor(es): Costa, Mónica Mendes da
Data: 2017
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10400.5/14408
Origem: Repositório da UTL
Projeto/bolsa: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/3599-PPCDT/PTDC%2FCVT%2F120122%2F2010/PT; info:eu-repo/grantAgreement/FCT/6817 - DCRRNI ID/UID%2FCVT%2F00276%2F2013/PT;
Assunto(s): Fatty acids; biohydrogenation; rumen bacteria; tannins; starch; Ácidos gordos; bioidrogenação; bactérias do rúmen; taninos; amido
Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade de Produção Animal
In the present thesis, four experiments were conducted to study how ruminal biohydrogenation pathways can be modulated through dietary inclusion of tannin sources and to acquire a better comprehension about the occurence of t10-shifted biohydrogenation pathways. In the first experiment, in vitro batch incubations with 100 g/kg dry matter (DM) of extracts of chestnut tannins (mostly hydrolysable tannins) and quebracho, grape seed or rockrose (Cistus ladanifer) condensed tannins, as well as a control treatment were incubated for 6 h with ruminal fluid from fistulated sheep and a dehydrated lucerne-based substrate with 60 g/kg DM of sunflower oil. Grape seed and, to a lesser extent, C. ladanifer led to a higher disappearance of 18:2n-6 with a consequent higher production of c9,t11-18:2 and t11-18:1 than chestnut, quebracho and control. There was no clear innibition of 18:0 production with any of the extracts comparing with control. In the second experiment, rumen fistulated sheep were fed tannin extracts from mimosa condensed tannins, chestnut hydrolysable tannins or their mixture (100 g/kg DM) in a complete diet with sunflower and linseed oils (40 g/kg DM), following a change-over design (3 treatments, 4 sheep and 4 periods). There was a variable inhibition of ruminal biohydrogenation and a lower “trans-/cis-18:1” ratio in bacterial fractions with mimosa than with chestnut. Mimosa led to a lower fermentative activity, as well as a lower abundance of Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens and Butyrivibrio proteoclasticus and higher abundance of Selenomonas ruminantium with a lower bacterial biomass estimate of dimethylacetals than chestnut. In the third experiment, two rumen fistulated rams were housed in metabolic cages and adapted to a wheat-based diet with 41 g/kg DM of sunflower oil. During the first two weeks of trial, the t10-shift occurred temporarily in both animals but in different moments. These results were probably due to individual variability of rumen microbiota, since, for a selected period of the trial, a lower bacterial diversity was found for ram 1 compared to ram 2. Moreover, the t10-shift was associated with an increase of total trans-18:1 and a decrease of 18:0. There was no clear association of t10-shift with rumen pH or its expression in blood plasma. In the fourth experiment, 40 lambs were fed, for 6 weeks, with complete diets containing barley or barley completely replaced for dehydrated citrus pulp, dehydrated beet pulp or soybean hulls. All diets were supplemented with an oil blend (soybean:fish oils, 59:10 g/kg DM). Overall, the t10-/t11-18:1 ratio was above 3 in meat and subcutaneous fat, although soybean hulls increased t11-18:1 and c9,t11-18:2 comparing with the other treatments. Citrus pulp led to the lowest gene expression of fatty acid synthase, while that of stearoyl-CoA desaturase was inferior for soybean hulls and beet pulp.
RESUMO - Modulação da bioidrogenação ruminal em ovinos através de taninos ou de fontes energéticas da dieta - A dieta dos ruminantes é um dos principais determinantes que influencia a bioidrogenação (BH) ruminal. A inclusão de taninos na dieta, os quais são compostos fenólicos das plantas, pode aumentar a proporção, no rúmen e nos tecidos, de ácidos gordos (AG) bioactivos com efeitos benéficos na saúde humana, tais como os ácidos vacénico (t11-18:1) e ruménico (c9,t11-18:2; conjugado do ácido linoleico - CLA) derivados das vias t11 da BH. A maior quantidade de c9,t11-18:2 presente nos tecidos resulta da dessaturação de t11-18:1 pela estearoil-CoA dessaturase (SCD; Δ9-dessaturase). Contudo, na presença de dietas com alto teor em amido e baixo conteúdo em forragem, com ou sem suplementação com óleos ricos em ácidos gordos polinsaturados, pode ocorrer uma modificação das vias da BH com predomínio das vias t10 relativamente às t11 (o shift-t10) e o concomitante aumento de AG deletérios para a saúde, nomeadamente t10-18:1 e t10,c12-18:2. Na presente tese, foram realizadas duas experiências com o propósito de estudar o efeito da inclusão de diversos tipos de taninos como moduladores da BH (experiências 1 e 2) e duas experiências para obter uma melhor compreensão dos factores que determinam a ocorrência do shift-t10 (experiências 3 e 4). Em todos os estudos, foram incorporados óleos de origem vegetal ou animal nas dietas para aumentar a formação de intermediários da BH. Na primeira experiência, foi realizado um ensaio in vitro com 100 g/kg de matéria seca (MS) de extractos de taninos da castanha (maioritariamente taninos hidrolisáveis) e de extractos de taninos condensados de quebracho, de sementes de uva e de esteva (Cistus ladanifer), bem como um tratamento controlo (sem taninos). As incubações decorreram durante 6 h com fluido de rúmen de ovinos fistulados e um substrato à base de luzerna desidratada com 60 g/kg MS de óleo de girassol (2:1, rácio “foragem/concentrado”). A composição em AG dos tubos de incubação foi obtida por transesterificação combinada, seguida da separação dos ésteres metílicos dos AG por cromatografia gás-líquido e da sua identificação com espectrometria de massa. Determinaram-se também a produção de ácidos gordos voláteis (AGV) e o pH do rúmen, tendo-se verificado apenas pequenas diferenças no pH. Os tratamentos com extractos de uva e, menos marcadamente, de C. ladanifer causaram um maior desaparecimento de ácido linoleico (c9,c12-18:2; 18:2n-6) e um consequente aumento do total de trans-18:1, nomeadamente de t11-18:1, e de c9,t11-18:2, bem como uma diminuição do total de dimetilacetais (DMA), comparativamente aos extractos de castanha e de quebracho e ao controlo, embora, considerando o total de DMA, esta diferença não tenha sido significativa para o caso do quebracho. Não houve uma clara inibição da produção de ácido esteárico (18:0) com nenhum dos tratamentos em comparação com o controlo, apesar do extracto de uva ter originado uma menor proporção de 18:0 relativamente ao total de produtos da BH. Na segunda experiência, ovinos fistulados foram alimentados com extractos comerciais de taninos da mimosa (condensados), da castanha (hidrolisáveis) e de uma mistura de ambos (100 g/kg MS) incorporados numa dieta completa (1:1, rácio “foragem/concentrado”) suplementada com uma mistura de óleos de girassol e linho (40 g/kg MS), segundo um desenho experimental de “change-over” (3 tratamentos, 4 animais and 4 períodos). Os períodos experimentais tiveram a duração de 3 semanas, includindo 2 semanas de adaptação às dietas e 1 semana de recolha de amostras. As amostras de conteúdo do rúmen foram obtidas antes da refeição da manhã em 2 dias das últimas semanas de cada período com um intervalo de 2 dias entre recolhas. No primeiro dia de amostragem, recolheram-se os conteúdos totais do rúmen para obtenção das bactérias associadas às fracções sólida (SAB) e líquida (LAB), enquanto, no segundo dia, os conteúdos foram usados para avaliação da actividade fermentativa (análise de pH e AGV). Em ambos os dias de recolha, as amostras de conteúdo do rúmen foram utilizadas para a análise de AG, bem como para a extracção de DNA e posterior quantificação do número de cópias de 16S rRNA de bactérias seleccionadas do rúmen. No último dia, recolheram-se amostras de sangue antes e 3 h depois da refeição da manhã. As dietas com extracto de mimosa e com a mistura de extractos causaram uma inibição da BH ruminal em algumas réplicas dos tratamentos e a mimosa originou ainda um menor rácio “trans-/cis-18:1” nas fracções bacterianas, comparativamente à dieta com extracto de castanha. A dieta com mimosa levou ainda a uma menor concentração do total de AGV, bem como a uma inferior abundância de Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens e Butyrivibrio proteoclasticus e a uma maior abundância de Selenomonas ruminantium, juntamente com um menor estimativa da biomassa bacteriana por DMA, em comparação com a castanha. Adicionalmente, o tratamento com mimosa originou um aumento do total de oxo-18:0, no plasma sanguíneo e no rúmen, em relação à castanha, enquanto, nas fracções bacterianas, este aumento verificou-se com a mistura de extractos comparativamente à média dos tratamentos com extractos de mimosa e de castanha. Na terceira experiência, dois carneiros fistulados foram colocados em caixas metabólicas e gradualmente adaptados a uma dieta à base de trigo com 41 g/kg MS de óleo de girassol. Durante os 29 dias de ensaio, recolheram-se amostras de conteúdo do rúmen, antes e 3h depois da refeição da manhã. Os conteúdos do rúmen foram também obtidos uma vez por semana a cada 1h30 entre as 9h30 e as 20h00 para a análise da composição em AG e dos grupos taxonómicos bacterianos, juntamente com amostras de sangue recolhidas antes e 3 h depois da refeição da manhã. O shift-t10 ocorreu progressiva e temporariamente nas primeiras duas semanas e coincidiu com um acréscimo de ingestão de alimento que se seguiu ao seu decréscimo. O padrão de indução do shift-t10 apresentou variabilidade individual, a qual foi provalmente causada por diferenças entre animais a respeito da microbiota do rúmen, na medida em que, num período definido do ensaio, verificou-se uma menor diversidade bacteriana no animal com maior rácio t10-/t11-18:1 (carneiro 1) do que no animal com menor rácio (carneiro 2). Considerando os grupos taxonómicos obtidos por pirossequenciação da região 16S rRNA do genoma bacteriano, a abundância dos filos Actinobacteria e, em menor extenção, Spirochaetae era maior no carneiro 1 em relação ao carneiro 2, contrariamente aos filos Bacteroidetes e Firmicutes. Para além disso, o shift-t10 estava associado ao aumento do total de trans-18:1 e à diminuição da produção de 18:0, bem como ao aumento prévio da formação de oxo-18:0 no rúmen. Não se verificou uma clara associação entre o estabelecimento do shift-t10 e a sua expressão no plasma sanguíneo e a redução do pH do conteúdo do rúmen. De facto, o aumento do rácio “t10-/t11-18:1” no rúmen não se encontrava relacionado com um maior rácio “t10-18:1/(t11-18:1 + c9,t11-18:2)” no plasma e, apenas num carneiro, ocorreu um aumento pós-prandial do rácio “t10-/t11-18:1” associado a uma redução do pH. Na quarta experiência, quarenta borregos foram alimentados, durante 6 semanas, com uma de quatro dietas completas (1:4, rácio “foragem/concentrado”) suplementadas com uma mistura de óleos de soja e de peixe (59:10 g/kg MS) e contendo, como principal fonte energética, cevada (42% MS) (cereal) ou cevada completamente substituída por polpa de citrinos desidratada, polpa de beterraba desidratada ou cascas de soja. Durante a experência, os parâmetros produtivos foram avaliados. Imediatamente após o abate dos animais, amostras de músculo Longissimus foram recolhidas para avaliação da expressão dos genes das enzimas síntase de ácidos gordos (FASN), SCD e acetil-CoA carboxilase (ACACA). Ao terceiro dia após o abate, obtiveram-se amostras de músculo e de gordura subcutânea para análise da composição em AG. A dieta com polpa de citrinos levou a uma redução do ganho de peso diário e a um aumento da probabilidade de desenvolver lesões mais severas de paraqueratose da mucosa do rúmen. As dietas com polpa de citrinos e com cascas de soja foram responsáveis pela diminuição da eficiência alimentar, comparativamente à dieta com cevada. Todos os tratamentos originaram um rácio “t10-/t11-18:1” acima de 3, na carne e na gordura subcutânea, apesar da dieta com cascas de soja ter causado um aumento de t11-18:1 e c9,t11-18:2 nos tecidos, comparativamente aos outros tratamentos. Adicionalmente verificou-se a menor expressão dos genes da FASN, com a dieta com polpa de citrinos, e da SCD, com as dietas com cascas de soja e polpa de beterraba.
