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O desenvolvimento de modelos tumorais tridimensionais fisiologicamente relevantes é essencial para reproduzir com precisão o microambiente tumoral e melhorar o valor preditivo dos testes de medicamentos in vitro. Este estudo investigou o uso da sericina, uma glicoproteína derivada da seda, como uma estrutura bioativa para promover a formação de esferoides e o seu efeito na resposta destes modelos aos medicamentos. Os esferoides heterotípicos compostos por células epiteliais do tecido mamário com carcinoma ductal (MCF-7) e fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) foram produzidos sob agitação orbital ao longo de 14 dias, variando a concentração de sericina de 0,025 a 0,2%. Simulações de dinâmica de fluidos computacional indicaram que a região central do poço de cultura apresenta reduzidas forças de cisalhamento, valores inferiores a <0,1 dyn/cm², apoiando a formação estável de esferoides. A análise morfométrica e a reconstrução tridimensional com AnaSP/ReViSP revelaram que a sericina promoveu maior coesão e integridade estrutural dos esferoides mostrando variabilidade em parâmetros como volume, diâmetro, circularidade e compactação. Estes modelos 3D heterotípicos enriquecidos com sericina foram utilizados para avaliar a atividade citotóxica da metformina em comparação com modelos 2D. A concentração inibitória IC₅₀ em culturas 2D de células MCF-7 foi de 19,44 mM após 48 horas, alinhando-se com os valores descritos na literatura (6–33 mM). Em esferoides 3D, a exposição a concentrações de metformina equivalentes a IC₅₀, 2×IC₅₀ e 3×IC₅₀ demonstrou eficácia reduzida em comparação com 2D, apresentando os esferoides uma atividade metabólica de 40-60%. Além disso, observou-se que a inclusão de sericina aumentou a resistência dos esferoides contra a metformina, o que está em linha com a melhoria verificada em parâmetros como a esfericidade e a compactação dos esferoides. Estes parâmetros contribuem para um maior efeito de barreira de difusão e resistência mediada por hipoxia, o que suporta a aplicação destes aglomerados celulares como modelos in vitro com maior capacidade de predição de resultados em humanos. Desta forma, os esferoides 3D suplementados com sericina apresentam um elevado potencial para aplicação na seleção de novos fármacos e em aplicações anti tumorais personalizadas. No futuro, a caracterização dos perfis de expressão de proteínas e genes nos esferoides 3D heterotípicos enriquecidos com sericina bem como a dinâmica de difusão de fármacos devem ser objeto de investigação para caracterizar em maior detalhe estes modelos.