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A micropropagação de plantas compreende um conjunto de ferramentas biotecnológicas utilizadas para a propagação in vitro de plantas. Nestas técnicas, as células iniciam um processo de reaquisição da totipotência. Durante a embriogénese somática (ES), as células sofrem uma reprogramação que leva à formação de uma estrutura semelhante a um embrião zigótico. As aplicações da ES abrangem desde a clonagem à transformação e edição genéticas. Apesar da identificação de genes relacionados com a competência embriogénica, as redes genéticas envolvidas permanecem vastamente incompreendidas.Solanum betaceum Cav. (tamarilho) é uma solanácea que produz frutos de elevado valor nutricional e económico. No entanto, devido à elevada taxa de polinização autogâmica e a constrangimentos fitossanitários, as técnicas convencionais de propagação são limitadas, fazendo da ES uma técnica adequada para a sua propagação clonal. A ES no tamarilho ocorre quando embriões zigóticos ou explantes de folha são cultivados num meio rico em auxina, levando à formação de duas linhas de callus distintas: embriogénica (CE) e não embriogénica (CNE). Posteriormente, o CE é transferido para um meio sem auxina, onde os embriões somáticos se desenvolvem. Esta espécie apresenta várias características que a tornam num sistema apropriado para estudar a ES, incluindo um CE de crescimento rápido e grande longevidade, a possibilidade de induzir a ES a partir de diferentes tipos de explantes e com diferentes auxinas e a fácil e prolífica conversão de embriões somáticos em plântulas.A análise de proteómica comparativa de CE e CNE derivados do mesmo explante permitiu a identificação de uma RNA metiltransferase (MTase) SpoU, a NEP-TC (Proteína do Calo Não Embriogénico de Tamarilho, número de acesso no GenBank JQ766254), maioritariamente encontrada em CNE. Embora estudos anteriores tenham descrito a NEP-TC como uma rRNA-MTase e reportado que os mutantes knock-down para o seu gene apresentam uma diminuição da taxa de indução da ES em comparação com o tipo selvagem, o seu modo de ação ainda não foi descrito.O estudo das RNA-MTases e das suas funções está em curso e algumas foram descritas como reguladoras do desenvolvimento das plantas e das respostas ao stresse. No entanto, o número de RNA-MTases vegetais identificadas e funcionalmente caracterizadas permanece limitado. Como a identificação dos alvos RNA é um primeiro passo para a compreensão do funcionamento destas enzimas, foram desenvolvidas técnicas de crosslink UV com imunoprecipitação (CLIP) para induzir uma ligação permanente entre o RNA e as proteínas ligadas a ele in vivo, permitindo o isolamento e a identificação destes alvos.O principal objetivo desta tese de doutoramento foi elucidar o mecanismo de regulação da ES que envolve as rRNA-MTases SpoU, incluindo a NEP-TC, em Solanum betaceum e Arabidopsis thaliana, a espécie-modelo vegetal para estudos genéticos e de desenvolvimento. Para além de caracterizar o gene da NEP-TC e de dois outros genes da mesma família, foi também desenvolvido o procedimento de transformação mediada por Agrobacterium em calos de S. betaceum e foi otimizado e aplicado um protocolo de CLIP de resolução nucleotídica individual melhorado (iiCLIP) a células de calos de S. betaceum, a partir do qual foi elaborada uma lista de possíveis alvos das rRNA-MTases SpoU.Em primeiro lugar, considerando que a metilação do RNA já estava associada à formação de raízes laterais através de um ensaio de single-cell RNA-seq, o desenvolvimento de plântulas e raízes e a indução da ES foram analisados em mutantes para o gene homólogo da NEP-TC em Arabidopsis e dois outros genes da mesma família. Os resultados sugerem que estas RNA-MTases podem desempenhar um papel na taxa de crescimento das plantas, no desenvolvimento das raízes e na indução da ES.Para introduzir um gene NEP-TC recombinado em células de calo de tamarilho e permitir o isolamento de complexos RNA-NEP-TC através da purificação por afinidade com caudas de Histidina, um protocolo de transformação de células de calo de tamarilho mediado por Agrobacterium foi desenvolvido com sucesso. No entanto, embora a expressão de EYFP e GUS fosse detetada durante a otimização do protocolo, as células utilizadas na transformação com o construto da NEP-TC não recuperaram após a transformação. Assim, mais otimizações são necessárias.Por fim, a técnica iiCLIP, uma variante ultra-eficiente, rápida e não isotópica do CLIP, foi aplicada a células de calo de S. betaceum utilizando um anticorpo previamente desenvolvido para uma região conservada do domínio metiltransferase da NEP-TC, permitindo a geração de um perfil epitranscriptómico da atividade das RNA-MTases SpoU em tamarilho.No geral, os resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos epitranscriptómicos que regulam indução da ES. Estas descobertas podem permitir o desenvolvimento de novas cultivares de espécies vegetais não convencionais com uma ES mais eficiente.

Plant micropropagation comprises a set of biotechnological tools designed for the in vitro propagation of plants. In these techniques, cells embark on a pathway of totipotency reacquisition. During somatic embryogenesis (SE), cells undergo reprogramming that leads to the formation of a structure similar to a zygotic embryo. Applications of SE range from cloning to genetic transformation and gene editing. Despite the identification of genes related to embryogenic competence, the genetic networks involved remain largely misunderstood.Solanum betaceum Cav. (tamarillo) is a solanaceous tree that produces fruits of high nutritional and economic value. However, due to its high rate of autogamous pollination and phytosanitary constraints, conventional propagation techniques are limited, making SE a suitable approach for its clonal propagation. SE in tamarillo occurs when zygotic embryos or leaf explants are cultured in an auxin-rich medium, leading to the formation of two distinct callus lines: embryogenic (EC) and non-embryogenic (NEC). Subsequently, EC is transferred to an auxin-free medium, where somatic embryos develop. This species presents several characteristics that make it an appropriate system for studying SE, including a fast-growing and long-lasting EC, the ability to induce SE from different explant types and with different auxins, and the ease and prolificity of somatic embryo conversion into plantlets.Comparative proteomic analysis of EC and NEC derived from the same explant enabled the identification of a SpoU RNA methyltransferase (MTase), NEP-TC (Non-Embryogenic Protein from Tamarillo Callus, GenBank accession number JQ766254), mostly found in NEC. Although previous studies have described NEP-TC as an rRNA-MTase and reported that knockdown mutants of its gene exhibit a decrease in SE induction rate compared to wild-type (WT), its mode of action has not yet been described.The study of RNA-MTases and their functions is ongoing, and some have been described as regulators of plant development and stress responses. However, the number of plant RNA-MTases identified and functionally characterised remains limited. As identifying RNA targets is a first step towards understanding how these enzymes work, UV crosslinking immunoprecipitation (CLIP) techniques were developed to induce a permanent crosslink between RNA and bound proteins in vivo, enabling the isolation and identification of these targets.The main objective of this PhD thesis was to elucidate the SE regulation mechanism that involves SpoU rRNA-MTases, including NEP-TC, in Solanum betaceum and Arabidopsis thaliana, the model plant species for genetic and developmental studies. In addition to characterising the NEP-TC gene and two other genes of the same family, the S. betaceum callus Agrobacterium-mediated transformation procedure was also developed, and an improved individual nucleotide resolution-CLIP (iiCLIP) protocol was optimised and applied to S. betaceum callus cells, from which a list of putative SpoU rRNA-MTases targets was elaborated.Firstly, taking into consideration that RNA methylation was already associated with lateral root formation through a single-cell RNA-seq assay, plantlet and root development and SE induction in mutants for Arabidopsis NEP-TC homologous gene and two other genes of the same family. The results suggest that these RNA-MTases may play a role in plant growth rate, root development and SE induction.To introduce a recombined NEP-TC gene into tamarillo callus cells and enable isolation of RNA-NEP-TC complexes via His-tag affinity purification, an Agrobacterium-mediated transformation protocol for tamarillo callus cells was successfully developed. Nevertheless, although EYFP and GUS expression was detected during protocol optimisation, the cells used in the transformation with the NEP-TC construct did not recover after transformation. Thus, further optimisations are needed.Finally, the iiCLIP technique, an ultra-efficient, fast, and non-isotopic CLIP variant, was applied to S. betaceum callus cells using an antibody previously developed against a conserved region of NEP-TC’s methyltransferase domain, enabling the generation of an epitranscriptome profile of SpoU RNA-MTases activity in tamarillo.Overall, the results contribute to a better understanding of the epitranscriptomic mechanisms that regulate SE induction. These findings may allow the development of new cultivars of non-conventional plant species with increased SE efficiency.