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Freshwater ecosystems are increasingly threatened by multiple anthropogenic stressors, including persistent and emerging contaminants. Among these, nanoplastics (NPs) have emerged as contaminants of growing environmental concern due to their small size, high reactivity, and ability to interact with co-occurring pollutants such as metals. However, despite increasing evidence of NP occurrence in freshwater systems, their impacts on ecosystem structure and functioning remains poorly understood, especially under ecologically realistic multi-stressor conditions. In small, forested streams, leaf litter decomposition is a fundamental ecosystem process primarily mediated by aquatic hyphomycetes and detritivorous macroinvertebrates, making these ecosystems particularly sensitive to anthropogenic disturbances that disrupt their communities and associated processes. This thesis investigated how polystyrene NPs, both bare and carboxylated, interact with metals to affect freshwater decomposer communities and ecosystem functioning across biological scales, from ecosystem- to cellular-level responses. To address this, a multidisciplinary approach combining microcosm experiments, community analyses, physiological assays and microscopy was applied under environmentally relevant conditions using stream waters from reference and metal-polluted sites. At the ecosystem and community levels, combined exposure to NPs and metals reduced fungal biomass, aquatic hyphomycete sporulation, leaf litter decomposition, and detritivore feeding rates. These effects were generally stronger for carboxylated NPs than for bare NPs, demonstrating the critical role of NP surface chemistry in determining ecological toxicity. Aquatic hyphomycete community composition was significantly altered under contaminant exposure, including shifts in species dominance and declines in community stability. At the biochemical and physiological levels, exposure to NPs and copper altered oxidative stress biomarkers and antioxidant defence responses in aquatic fungal communities, including alterations in metallothionein levels, hydrogen peroxide production, and antioxidant enzyme activities (SOD, CAT, and GPx). These indicators revealed key detoxification pathways and provided mechanistic links between contaminant exposure and impairment of ecosystem processes. At the cellular level, combined exposure to copper and NPs increased reactive oxygen species (ROS) accumulation and plasma membrane disruption in the freshwater fungus Articulospora tetracladia. Carboxylated NPs induced stronger cellular damage than bare NPs, likely due to enhanced interactions with metal ions and cell membranes. These effects were accompanied by reductions in fungal growth and physiological performance, confirming the central role of NP surface chemistry in modulating toxicity mechanisms. This thesis also evaluated whether prior acclimation to metal contamination confers cross-tolerance to NPs. Results showed limited cross-protection, with metal-adapted fungi remaining vulnerable to NP exposure. Overall, the findings demonstrate that NPs act as key modulators of metal toxicity in freshwater ecosystems, with effects propagating across multiple levels of biological organisation. These results further highlight the vulnerability of microbial decomposer communities to emerging contaminants, providing a mechanistic and predictive framework for understanding multi-stressor impacts and supporting improved ecological risk assessment and environmental management strategies.

Os ecossistemas de água doce estão cada vez mais ameaçados por múltiplos fatores de stress antropogénicos, incluindo contaminantes persistentes e emergentes. Entre estes, os nanoplásticos (NPs) surgiram como contaminantes de crescente preocupação ambiental devido ao seu reduzido tamanho, elevada reatividade e capacidade de interagir com poluentes coexistentes, como os metais. No entanto, apesar das evidências crescentes da ocorrência de NPs em sistemas de água doce, os seus impactos na estrutura e funcionamento dos ecossistemas permanecem pouco compreendidos, especialmente em condições ecologicamente realistas de múltiplos fatores de stress. Em pequenos riachos florestais, a decomposição da matéria foliar é um processo ecossistémico fundamental mediado principalmente por hifomicetes aquáticos e macroinvertebrados detritívoros, tornando estes ecossistemas particularmente sensíveis a perturbações antropogénicas que afetam as suas comunidades e os processos associados. Esta tese investigou de que forma os NPs de poliestireno, tanto não funcionalizados como carboxilados, interagem com metais afetando as comunidades decompositoras de água doce e o funcionamento dos ecossistemas em diferentes escalas biológicas, desde respostas ao nível ecossistémico até ao nível celular. Para tal, foi aplicada uma abordagem multidisciplinar que combinou experiências em microcosmos, análises de comunidades, ensaios fisiológicos e microscopia sob condições ambientalmente relevantes, utilizando águas de riachos provenientes de locais de referência e de locais poluídos por metais. Ao nível do ecossistema e das comunidades, a exposição combinada a NPs e metais reduziu a biomassa fúngica, a esporulação de hifomicetes aquáticos, a decomposição da matéria foliar e as taxas de alimentação dos detritívoros. Estes efeitos foram geralmente mais pronunciados para os NPs carboxilados do que para os NPs não funcionalizados, demonstrando o papel crítico da química superficial dos NPs na determinação da toxicidade ecológica. A composição das comunidades de hifomicetes aquáticos foi significativamente alterada sob exposição aos contaminantes, incluindo mudanças na dominância das espécies e reduções na estabilidade das comunidades. Ao nível bioquímico e fisiológico, a exposição a NPs e cobre alterou biomarcadores de stress oxidativo e respostas de defesa antioxidante em comunidades fúngicas aquáticas, incluindo alterações nos níveis de metalotioneínas, na produção de peróxido de hidrogénio e nas atividades de enzimas antioxidantes (SOD, CAT e GPx). Estes indicadores revelaram vias-chave de desintoxicação e forneceram ligações mecanísticas entre a exposição aos contaminantes e o comprometimento dos processos ecossistémicos. Ao nível celular, a exposição combinada a cobre e NPs aumentou a acumulação de espécies reativas de oxigénio (ROS) e a disrupção da membrana plasmática no fungo de água doce Articulospora tetracladia. Os NPs carboxilados induziram danos celulares mais severos do que os NPs não funcionalizados, provavelmente devido ao aumento das interações com iões metálicos e membranas celulares. Estes efeitos foram acompanhados por reduções no crescimento fúngico e no desempenho fisiológico, confirmando o papel central da química superficial dos NPs na modulação dos mecanismos de toxicidade. Esta tese avaliou também se a aclimatação prévia à contaminação por metais confere tolerância cruzada aos NPs. Os resultados demonstraram uma proteção cruzada limitada, com fungos adaptados a metais permanecendo vulneráveis à exposição a NPs. De forma geral, os resultados demonstram que os NPs atuam como moduladores importantes da toxicidade dos metais em ecossistemas de água doce, com efeitos que se propagam por múltiplos níveis de organização biológica. Estes resultados evidenciam ainda a vulnerabilidade das comunidades microbianas decompositoras a contaminantes emergentes, fornecendo um quadro mecanístico e preditivo para compreender os impactos de múltiplos fatores de stress e apoiar estratégias melhoradas de avaliação de risco ecológico e gestão ambiental.