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Forest nurseries play a central role in reforestation and ecosystem restoration and are currently challenged to intensify production sustainably without compromising plant quality and resilience. Agrochemicals with lower environmental impact, such as phosphite, are increasingly used due to their fungicidal and biostimulant properties; however, their effects on the rhizosphere microbiome (rhizobiome) remain poorly characterized. Rhizobiome manipulation to promote plant development and health, is emerging as a promising strategy, although it is still underexplored in forest species under nursery conditions. Within this scope, the genus Pinus, due to its socioeconomic and environmental relevance, is one of the most commonly produced genera in commercial nurseries. This thesis explores approaches to sustainable pine production in nurseries, with a focus on strategies based on rhizome manipulation. The effects of phosphite on the physiological response (gas exchange) and rhizome of Pinus radiata (6 months) were evaluated considering two modes of application: foliar and irrigation. Irrigation application reduced the bacterial diversity of the rhizobiome, while foliar application caused significant yellowing of the needles, with no changes in gas exchange parameters. These results indicate that, although considered less harmful to the environment, phosphite can negatively affect bacterial communities in the rhizosphere. As a more sustainable alternative, the potential of plant growth-promoting bacteria (PGPB), isolated from the root of Pinus pinea and applied to P. radiata seeds to improve germination and plant quality, was explored. Sixty-eight endophytic strains, predominantly from Paenibacillaceae and Bacillaceae, were isolated, from which ten formulations were developed. Germination and physiological quality indicators (primary and secondary metabolism) were evaluated. Formulations P4 and C3 increased the germination rate compared to the control, while P5 increased the amino acid content. These consortia (P4, P5, and C3) were selected to evaluate the feasibility and effectiveness of applying PGPB under real production conditions in a forest nursery. The consortia were applied by seed imbibition (imbibition) and by imbibition followed by soil inoculation after germination (reinoculation). In P. radiata (4 months), re-inoculation with P5 improved photosynthetic performance, while P4 promoted an increase in amino acids, phenolic compounds, and flavonoids. In P. pinaster, imbibition (P5 and C3) had a negative effect on metabolism and germination. Nevertheless, the application of PGPB increased the richness and diversity of the rhizobiome in both species, with enrichment of PGPB families such as Rhodanobacteraceae and Acidobacteriaceae, more pronounced in P. pinaster. Finally, the effect of co-planting on the rhizobiome and disease resistance was evaluated. Pinus radiata (more susceptible) was planted in pots with P. pinea (more resistant) for one year. After this period, the test plants (Pinus radiata) were inoculated with Fusarium circinatum, the causal agent of Pine Pitch Canker and evaluated 8 weeks later for: symptoms, biochemical and physiological parameters, gene expression and rhizobiome. In mixed plantations, there was a 14-day delay in the appearance of symptoms and a decrease in the expression of genes associated with pathogenesis (pr3 and pr5), with no change in gas exchange parameters. A “cry-for-help” mechanism was also observed in the rhizobiome, reflected in an enrichment of the rhizosphere with taxa associated with plant defense (e.g., Xanthobacteraceae). In summary, these results show that (i) the application of agrochemicals such as phosphite, although indicated as more sustainable, can negatively affect the rhizobiome, especially when applied via irrigation; (ii) P. pinea contains PGPB with positive effects on the germination and physiology of P. radiata; (iii) the formulated bacterial consortia influenced germination and physiology of P. radiata and P. pinaster under operational conditions, with the response depending on the application method and species (iv) co-planting of species with different levels of disease resistance modulated the rhizobiome of P. radiata and delayed the manifestation of symptoms caused by F. circinatum. Overall, this work demonstrates the important role of the rhizobiome in plant quality and resistance. It also shows that the application of PGPB is a strategy with potential for application in young pine seedlings, positioning microbiome-based strategies as potential tools for sustainable production in forest nurseries.

Os viveiros florestais desempenham um papel central na reflorestação e no restauro de ecossistemas, enfrentando atualmente o desafio de intensificar a produção de forma sustentável sem comprometer a qualidade e resiliência das plantas. Agroquímicos de menor impacto ambiental, como o fosfito, são cada vez mais utilizados pelas suas propriedades fungicidas e bioestimulantes; ainda assim, o seu impacto no microbioma da rizosfera (rizobioma) permanece pouco estudado. A manipulação do rizobioma para promover o desenvolvimento e qualidade das plantas, emerge como estratégia promissora, embora ainda pouco explorada em espécies florestais em contexto de viveiro. Neste âmbito, o género Pinus, em resultado da sua relevância socioeconómica e ambiental é um dos géneros mais produzidos em viveiros comerciais. Esta tese explora abordagens de produção sustentável de pinheiros em viveiro, com foco em estratégias baseadas na manipulação do rizobioma. Os efeitos do fosfito na resposta fisiológica (trocas gasosas) e no rizobioma de Pinus radiata (6 meses) foram avaliados considerando dois modos de aplicação: foliar e por rega. A aplicação por rega reduziu a diversidade bacteriana do rizobioma, enquanto a aplicação foliar causou amarelecimento significativo nas agulhas, sem alterações ao nível das trocas gasosas. Estes resultados indicam que, apesar de considerado menos prejudicial para o ambiente, o fosfito pode afetar negativamente as comunidades bacterianas da rizosfera.Como alternativa mais sustentável, explorou-se o potencial de bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCP), isoladas da raiz de Pinus pinea, aplicadas a sementes de P. radiata para melhorar a germinação e a qualidade da planta. Foram isoladas 68 estirpes endofíticas, predominantemente de Paenibacillaceae e Bacillaceae, a partir das quais se desenvolveram dez formulações. Avaliaram-se a germinação e indicadores fisiológicos de qualidade (metabolismo primário e secundário). As formulações P4 e C3 aumentaram a taxa de germinação face ao controlo, enquanto P5 aumentou o conteúdo em aminoácidos. Estes consórcios (P4, P5 e C3) foram selecionados para avaliar a viabilidade e eficácia da aplicação de BPCP em condições reais de produção num viveiro florestal. Os consórcios foram aplicados por embebição das sementes (embebição) e por embebição seguida de inoculação do solo após germinação (reinoculação). Em P. radiata (4 meses), a reinoculação com P5 melhorou o desempenho fotossintético, enquanto P4 promoveu o aumento de aminoácidos, compostos fenólicos e flavonoides. Em P. pinaster, a embebição (P5 e C3) teve efeito negativo no germinação e metabolismo . Ainda assim, a aplicação de BPCP aumentou a riqueza e diversidade do rizobioma em ambas as espécies, com enriquecimento de famílias BPCP como Rhodanobacteraceae e Acidobacteriaceae, mais pronunciado em P. pinaster. Por fim, avaliou-se o efeito da plantação conjunta no rizobioma e na resistência a doenças. Pinus radiata (mais suscetível) foi plantado em vasos com P. pinea (mais resistente), durante um ano. Após este período, as plantas teste (Pinus radiata) foram inoculadas com Fusarium circinatum, agente causador do Cancro Resinoso do Pinheiro, e avaliadas 8 semanas depois relativamente à sintomatologia, parâmetros bioquímicos e fisiológicos, expressão génica e rizobioma. Em plantação mista verificou-se um atraso de 14 dias no aparecimento de sintomas e decréscimo na expressão de genes associados à patogénese (pr3 e pr5), sem alteração nos parâmetros de trocas gasosas. Verificou-se ainda um mecanismo de “cry-for-help” no rizobioma, refletido num enriquecimento da rizosfera com taxa associados à defesa da planta (e.g. Xanthobacteraceae). Em suma, estes resultados mostram que (i) aplicação de agroquímicos como o fosfito, embora indicado como mais sustentável, pode afetar negativamente o rizobioma, sobretudo quando aplicado por irrigação; (ii) P. pinea contém BPCP com efeitos positivos na germinação e fisiologia de P. radiata. (iii) os consórcios bacterianos formulados influenciaram a germinação e fisiologia de P. radiata e P. pinaster, em condições operacionais, sendo a resposta dependente do método de aplicação e da espécie (iv) a plantação conjunta de espécies com níveis diferentes de resistência a doenças modula o rizobioma de P. radiata e atrasa a manifestação de sintomas causados por F. circinatum. De forma global, este trabalho demonstra o papel importante do rizobioma na qualidade e resistência da planta. Evidencia também que a aplicação de BPCP é uma estratégia com potencial para a aplicação em pinheiros jovens, posicionando as estratégias baseadas no microbioma como potenciais ferramentas para a produção sustentável em viveiros florestais.