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Introduction. Cervical cancer screening based on human papillomavirus (HPV) detection has limited specificity for distinguishing transient from persistent infections with transforming potential. The detection of cervical intraepithelial neoplasia through blood-based liquid biopsy remains challenging because systemic dissemination of viral DNA during these precursor stages is uncertain. In this context, this pilot study evaluated the potential of analysing structural features of host-derived cell-free DNA (cfDNA) for risk stratification of cervical lesions associated with HPV16 infection, integrating tissue molecular information to explore the biological basis of the alterations observed in circulation. Materials and Methods. A prospective, non-interventional pilot study was conducted in an initial cohort of women with HPV16 infection (n=68) and a healthy control group (n=20).cfHPV-DNA was assessed in plasma and extracellular vesicles (EVs) using droplet digital PCR (ddPCR). Structural features of host cfDNA were analysed by high-resolution capillary electrophoresis and subsequently evaluated in a cohort without systemic confounding factors (n=61). Methylation of selected genomic regions was quantified in formalin-fixed, paraffinembedded (FFPE) cervical biopsies, contributing to the assessment of a risk-stratification model (n=28). A surveillance subcohort (n=39) was followed for 6 months to assess the relationship between the parameters investigated and the evolution of viral infection. Results. cfHPV-DNA was undetectable in EVs and was identified at residual levels in one plasma sample, corresponding to a patient with multicentric disease. Analysis of host cfDNA revealed significant alterations in fragmentation features associated with HPV16 infection.Some of these features were associated with the presence of more severe cervical lesions.Analysis of tissue molecular markers also revealed associations with lesion severity, providing biological support for the structural alterations observed in circulating cfDNA. An integrated risk-stratification model incorporating clinical and molecular parameters was developed and showed discriminatory capacity for the identification of more severe lesions.Internal evaluation demonstrated consistent model performance and adequate calibration.During follow-up, the cfDNA fragmentation profile reflected lesion severity at diagnosis but did not demonstrate predictive value for viral clearance at 6 months. Discussion and Conclusions. Systemic dissemination of viral DNA appears to be residual in intraepithelial lesions. In contrast, HPV16 infection is associated with quantifiable structural alterations in host-derived cfDNA. The findings support the potential of cfDNA fragmentation analysis, integrated with clinical and molecular information, as a liquid-biopsy approach for risk stratification in women with a positive HPV test. This strategy may ultimately contribute to optimising clinical referral and follow-up, with the potential to reduce unnecessary referrals for colposcopy. External validation in multicentre cohorts, expansion to other high-risk genotypes, and longitudinal assessment of this signature represent important steps towards future clinical application.

Introdução. O rastreio do cancro do colo do útero, baseado na deteção do Vírus do Papiloma Humano (VPH), apresenta uma especificidade limitada na distinção entre infeções transitórias e persistentes com potencial transformante. A deteção sanguínea de neoplasias intraepiteliais do colo do útero, através de biópsia líquida, permanece um desafio devido à natureza controversa da disseminação sistémica de ADN viral durante as fases precursoras.Neste contexto, este estudo piloto avaliou o potencial da análise de características estruturais do ADN livre circulante (cfDNA) do hospedeiro para a estratificação da gravidade de lesões cervicais associadas à infeção por HPV16, integrando informação molecular tecidular para explorar a base biológica das alterações observadas em circulação. Materiais e Métodos. Foi realizado um estudo piloto prospetivo e não intervencional, envolvendo uma coorte inicial de mulheres com infeção por HPV16 (n=68) e um grupo controlo saudável (n=20). A presença de cfHPV-DNA foi avaliada em plasma e vesículas extracelulares (EVs) através de PCR digital em gotículas (ddPCR). As características estruturais do cfDNA do hospedeiro foram analisadas por eletroforese capilar de alta resolução e posteriormente avaliadas numa coorte isenta de fatores de confusão sistémicos(n=61). A metilação de regiões genómicas selecionadas foi quantificada em biópsias cervicais incluídas em parafina e fixadas em formalina (FFPE), contribuindo para a avaliação de um modelo de estratificação de risco (n=28). Uma subcoorte em vigilância (n=39) foi seguida aos 6 meses para avaliar a relação entre os parâmetros estudados e a evolução da infeção viral. Resultados. O cfHPV-DNA foi indetetável nas EVs e identificado de forma residual numa amostra plasmática, correspondente a uma doente com doença multicêntrica. A análise do cfDNA do hospedeiro revelou alterações significativas nas características de fragmentação associadas à infeção por HPV16. Algumas destas características apresentaram uma associação com a presença de lesões cervicais de maior gravidade. A análise de marcadores moleculares tecidulares revelou igualmente associações com a gravidade das lesões, fornecendo suporte biológico para as alterações estruturais observadas no cfDNAcirculante. Com base na integração de diferentes parâmetros clínicos e moleculares, foi desenvolvido um modelo de estratificação de risco com capacidade discriminativa para a identificação de lesões de maior gravidade. A avaliação interna do modelo demonstrou resultados consistentes e adequada calibração. Relativamente ao seguimento, o perfil de fragmentação do cfDNA refletiu a gravidade da lesão no momento do diagnóstico, mas não demonstrou valor preditivo para a eliminação viral aos 6 meses. Discussão e Conclusões. A disseminação sistémica de ADN viral demonstra ser residual em lesões intraepiteliais. Em contrapartida, a infeção por HPV16 está associada a alterações estruturais quantificáveis no cfDNA do hospedeiro. Os resultados obtidos suportam o potencial da análise de fragmentação do cfDNA, integrada com informação clínica e molecular, como abordagem de biópsia líquida para a estratificação de risco de mulheres com teste de HPV positivo. Esta estratégia poderá contribuir futuramente para otimizar o encaminhamento e acompanhamento clínico, reduzindo referenciações desnecessárias para colposcopia. A validação externa em coortes multicêntricas, a expansão a outros genótipos de alto risco e a avaliação longitudinal desta assinatura constituem passos importantes para a sua futura aplicação clínica.