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Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii is now recognized as a major global threat to healthcare systems. This pathogen exhibits resistance to multiple last-resort antibiotics and readily acquires and disseminates antimicrobial resistance (AMR) genes. Its high disease severity and global clinical burden led the World Health Organization (WHO) to classify A. baumannii as a critical-priority pathogen in the 2024 WHO Bacterial Priority Pathogens List. Clinical isolates often display high levels of AMR, with fluoroquinolone resistance, particularly to ciprofloxacin, being especially prevalent. In addition to drug resistance, A. baumannii is notable for its strong capacity to form biofilms, which relies on several factors, including Csu pili, AbOmpA, Bap, BfmRS system, and AbaI/AbaR quorum-sensing system. A positive correlation between AMR and biofilm formation has been reported in this species. Biofilms confer multiple survival advantages, including enhanced tolerance to antimicrobial agents, protection against host immune factors, desiccation and nutrient limitation, and facilitation of long-term persistence in hospital environments. The present study investigated whether and by which mechanisms ciprofloxacin resistance and biofilm formation may be co-regulated in A. baumannii. First, ciprofloxacin resistance was induced in the reference strain A. baumannii ATCC 19606, generating an isogenic ciprofloxacin-resistant derivative (A. baumannii CipR) with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 128 μg/mL. Acquisition of ciprofloxacin resistance significantly reduced the growth rate (P≤0.001) and metabolic activity (P≤0.0001) in the A. baumannii CipR strain. Decreased virulence of A. baumannii CipR was also observed in Calu-3 epithelial cells, when compared with the ciprofloxacin-susceptible strain, the A. baumannii CipS. Biofilm assays revealed that A. baumannii CipR produced significantly greater biofilm biomass when compared with A. baumannii CipS, as quantified by both crystal violet staining (P ≤ 0.0001) and viable cell counts (CFU/mL in biofilms) (P ≤ 0.001). A strong positive correlation was observed between ciprofloxacin resistance and biofilm formation (Rs = 0.9818, P ≤ 0.0001). Minimum biofilm eradication concentrations (MBECs) were also markedly elevated in A. baumannii CipR, reaching 10.000 μg/mL. Whole-genome sequencing of A. baumannii CipR identified mutations in gyrB (DNA gyrase B) and in a major facilitator superfamily (MFS) transporter genes. Gene expression analysis showed overexpression of the AbaI/AbaR quorum-sensing system. Inhibition of quorum-sensing with sub-MIC of streptomycin reduced biofilm formation without altering ciprofloxacin resistance levels. Efflux pumps inhibition with CCCP did not impact either biofilm formation or ciprofloxacin resistance in both A. baumannii CipS and A. baumannii CipR, suggesting the existence of other co-regulating mechanisms. The obtained results demonstrate that ciprofloxacin resistance resulted from several mutations, including in gyrB. This resistance simultaneously triggered biofilm formation significantly in A. baumannii, being observed a strong positive correlation between biofilm formation and ciprofloxacin resistance, and also led to a reduced bacterial fitness, metabolism, and virulence. The findings suggest that ciprofloxacin resistance, biofilm formation, and virulence may be co-regulated in A. baumannii, possibly through quorum-sensing and other yet-to-be-identified regulatory networks. These results provide novel insights into the adaptive mechanisms of A. baumannii and highlight potential targets for therapeutic intervention.

A bactéria Acinetobacter baumannii multirresistente é hoje reconhecida como uma grande ameaça global para os sistemas de saúde. Este agente patogénico apresenta resistência a múltiplos antibióticos de última geração e adquire e dissemina facilmente genes de resistência antimicrobiana (RAM). A elevada gravidade da doença e a carga clínica global levaram a Organização Mundial da Saúde (OMS) a classificar a A. baumannii como um agente patogénico de prioridade crítica na Lista de Patógenos Bacterianos Prioritários da OMS de 2024. Os isolados clínicos exibem frequentemente níveis elevados de RAM, sendo a resistência às fluoroquinolonas, particularmente à ciprofloxacina, especialmente prevalente. Para além da RAM, a A. baumannii destaca-se pela sua forte capacidade de formar biofilmes, que depende de diversos fatores, entre os quais Csu pili, AbOmpA, Bap, sistema BfmRS e o sistema de quórum-sensing AbaI/AbaR. Uma correlação positiva entre a RAM e a formação de biofilme tem sido reportada nesta espécie. Os biofilmes conferem múltiplas vantagens de sobrevivência, incluindo uma maior tolerância aos agentes antimicrobianos, proteção contra fatores imunitários do hospedeiro, dessecação e limitação de nutrientes, além de facilitarem a persistência a longo prazo em ambientes hospitalares. O presente estudo investigou se e por que mecanismos, a resistência à ciprofloxacina e a formação de biofilme podem ser co-reguladas em A. baumannii. Em primeiro lugar, a resistência à ciprofloxacina foi induzida na estirpe de referência A. baumannii ATCC 19606, gerando um derivado isogénico resistente à ciprofloxacina (A. baumannii CipR) com uma concentração mínima inibitória (CMI) de 128 μg/mL. A aquisição de resistência à ciprofloxacina reduziu significativamente a taxa de crescimento (P≤0,001) e a atividade metabólica (P≤0,0001) na estirpe A. baumannii CipR. A virulência reduzida de A. baumannii CipR foi também observada nas células epiteliais Calu-3, quando comparada com a estirpe sensível à ciprofloxacina, A. baumannii CipS. Os ensaios de biofilme revelaram que A. baumannii CipR produziu biomassa de biofilme significativamente maior em comparação com A. baumannii CipS, como quantificado pela coloração com cristal violeta (P≤0,0001) e pela contagem de células viáveis (UFC/mL em biofilmes) (P≤0,001). Foi observada uma forte correlação positiva entre a resistência à ciprofloxacina e a formação de biofilme (Rs = 0,9818, P≤0,0001). As concentrações mínimas de erradicação do biofilme (CMEB) foram também marcadamente elevadas em A. baumannii CipR, atingindo 10000 μg/mL. A sequenciação do genoma completo de A. baumannii CipR identificou mutações em gyrB (DNA girase B) e em genes transportadores da superfamília de facilitadores principais (MFS). A análise da expressão génica mostrou uma sobreexpressão do sistema de quórum-sensing AbaI/AbaR. A inibição do quórum-sensing com concentrações sub-CMI de estreptomicina reduziu a formação de biofilme sem alterar os níveis de resistência à ciprofloxacina. A inibição das bombas de efluxo com CCCP não teve impacto na formação de biofilme nem na resistência à ciprofloxacina em A. baumannii CipS e A. baumannii CipR, sugerindo a existência de outros mecanismos de co-regulação. Os resultados obtidos demonstram que a resistência à ciprofloxacina resultou de várias mutações, incluindo em gyrB. Esta resistência desencadeou simultaneamente a formação significativa de biofilme em A. baumannii, sendo observada uma correlação positiva significante entre a formação de biofilmes e a resistência à ciprofloxacina e levou ainda a uma redução da aptidão, do metabolismo e da virulência bacteriana. Os resultados sugerem que a resistência à ciprofloxacina, a formação de biofilme e a virulência podem ser co-reguladas em A. baumannii, possivelmente através do quórum-sensing e de outras redes regulatórias ainda não identificadas. Estes resultados fornecem novas perspetivas sobre os mecanismos adaptativos de A. baumannii e destacam potenciais alvos para intervenção terapêutica.