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Preserving cognitive function in aging and metabolic disease represents a major clinical and societal challenge, given the growing burden of dementia and the limited availability of effective disease-modifying therapies. Increasing evidence indicates that impairment in neurovascular coupling (NVC) plays a central role in this process by disrupting the precise matching between neuronal activity and cerebral blood flow (CBF). Among the mechanisms underlying NVC impairment, reduced nitric oxide (•NO) bioavailability has emerged as a key link between vascular and metabolic risk factors and cognitive decline. However, strategies capable of restoring or preserving •NO bioavailability in the brain remain limited. In this context, the nitrate-nitrite-•NO pathway represents an alternative, oxygen-independent source of •NO, with particular relevance under pathological conditions such as hypoperfusion and metabolic dysfunction.The present work aimed to study the protective and therapeutic potential of inorganic nitrate supplementation, via the nitrate-nitrite-•NO pathway, in preserving neurovascular and cognitive function, using complementary preclinical models of vascular cognitive impairment, namely chronic cerebral hypoperfusion (CCH) and type 2 diabetes (T2D). By investigating this endogenous, diet-dependent metabolic axis of •NO generation, the study aimed to elucidate physiologically relevant mechanisms governing cerebral blood flow regulation, brain energy metabolism, and ultimately the maintenance of cognitive function, thereby opening avenues for targeted nutritional interventions to prevent and modulate vascular dysfunction–associated cognitive decline.The first step was to establish the biochemical plausibility of nitrite reduction to •NO under conditions of low pH and oxygen tension, mimicking in vitro the cerebral microenvironment of hypoperfusion. We demonstrated that inorganic nitrite is readily reduced to •NO in a pH- and concentration-dependent manner and that this reaction is enhanced by ascorbate, a major physiological reductant in the brain. This evidence supports a redox-dependent mechanism for alternative •NO generation under hypoxic conditions.Building on these findings, we next investigated whether increasing the availability of nitrate-nitrite-derived •NO could modulate neurovascular function in vivo. Acute intracerebroventricular administration of nitrite significantly enhanced the hemodynamic response to glutamatergic stimulation in rats subject to cerebral hypoperfusion, demonstrating that •NO precursors can rapidly improve neurovascular responsiveness under conditions of impaired perfusion. These results provide direct evidence that the nitrate-nitrite-•NO pathway is functionally active in the brain and capable of supporting activity-dependent increases in CBF.We then evaluated the impact of long-term dietary nitrate supplementation in models of chronic neurovascular dysfunction. In both the CCH model and in young Goto-Kakizaki (GK) rats representing early-stage T2D, nitrate supplementation preserved hippocampal NVC, as evidenced by improved CBF responses to neuronal activation. These neurovascular improvements were accompanied by improved performance on hippocampal-dependent spatial memory tasks, indicating a functional link between restored NVC and cognitive outcomes. Mechanistically, these effects were associated with a reduction in NADPH oxidase activity, suggesting attenuation of superoxide radical production and potential ensued oxidative distress and preservation of •NO bioavailability as key contributors to the observed benefits.To further elucidate the molecular basis of these effects, redox proteomic analysis was performed in hippocampal tissue, aiming at the identification of redox-sensitive pathways and potential protein mediators underlying the observed neurovascular and cognitive modulation. These revealed that nitrate supplementation modulated the relative abundance of proteins involved in vascular and redox pathways, and also in synaptic function, including components of glutamatergic neurotransmission and glutathione metabolism. These findings indicate that the beneficial effects of nitrate extend beyond vascular regulation and may involve broader neuroprotective mechanisms linked to synaptic integrity and cellular redox homeostasis.Importantly, the efficacy of nitrate supplementation was strongly dependent on the stage of disease progression. While preventive administration in early-stage diabetes effectively preserved neurovascular and cognitive function, initiation of nitrate treatment in adult GK rats with established neurovascular dysfunction and cognitive impairment results in only partial or limited recovery. Despite measurable effects on neurovascular parameters, nitrate supplementation was insufficient to fully restore hippocampal function at advanced stages, suggesting that structural and molecular alterations become less reversible over time.

Preservar a função cognitiva no envelhecimento e nas doenças metabólicas constitui um importante desafio clínico e social, dada a crescente prevalência de demência e a limitada disponibilidade de terapias modificadoras da doença. Evidência crescente indica que o comprometimento do acoplamento neurovascular (ANV) desempenha um papel central neste processo, ao perturbar a correspondência precisa entre atividade neuronal e fluxo sanguíneo cerebral (FSC). Entre os mecanismos subjacentes ao comprometimento do ANV, a redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (•NO) destaca-se como um elo crítico entre fatores de risco vascular/metabólico e declínio cognitivo. Neste contexto, a via nitrato-nitrito-•NO representa uma fonte alternativa de •NO, independente de oxigénio, com particular relevância em condições patológicas como a hipoperfusão e a disfunção metabólica.Este trabalho teve como objetivo estudar o potencial protetor e terapêutico da suplementação de nitrato inorgânico, através da via nitrato-nitrito-•NO, na preservação da função neurovascular e cognitiva, utilizando modelos pré-clínicos complementares de comprometimento cognitivo vascular: hipoperfusão cerebral crónica (HCC) e diabetes tipo 2 (DT2). Ao explorar este eixo metabólico endógeno de produção de •NO dependente da dieta, o estudo pretendeu clarificar mecanismos com relevância fisiológica para a regulação do fluxo sanguíneo cerebral, do metabolismo energético e, em última análise, da manutenção da função cognitiva, abrindo perspetivas para intervenções nutricionais dirigidas na prevenção e modulação do declínio cognitivo associado a disfunção vascular.O primeiro passo consistiu em estabelecer a plausibilidade bioquímica da redução de nitrito inorgânico a •NO em condições de baixo pH e reduzida tensão de oxigénio, reproduzindo in vitro o microambiente cerebral da hipoperfusão. Demonstrámos que o nitrito é reduzido a •NO de forma dependente do pH e da concentração e que esta reação é potenciada por ascorbato, um eficiente redutor fisiológico no cérebro. Estas evidências suportam um mecanismo dependente de alterações redox para a produção alternativa de •NO em condições de hipóxia.Com base nestes resultados, investigámos de seguida se o aumento da disponibilidade de •NO proveniente da redução de nitrato/nitrito poderia modular a função neurovascular in vivo. A administração intracerebroventricular aguda de nitrito aumentou a resposta hemodinâmica à estimulação glutamatérgica em ratos submetidos a hipoperfusão cerebral, demonstrando que os precursores de •NO podem melhorar rapidamente a resposta neurovascular em condições de perfusão comprometida. Estes resultados fornecem evidência direta de que a via nitrato-nitrito-•NO é funcionalmente ativa no cérebro e capaz de sustentar aumentos do FSC dependentes da atividade neuronal.De seguida, avaliámos o impacto da suplementação dietética de nitrato a longo prazo em modelos de disfunção neurovascular crónica. Tanto no modelo HCC como em ratos jovens Goto-Kakizaki (GK), representando o estadio inicial da DT2, a suplementação de nitrato preservou a conectividade neurovascular hipocampal, como evidenciado pela melhoria das respostas do FSC à ativação neuronal. Estas alterações neurovasculares foram acompanhadas por um desempenho superior em tarefas de memória espacial dependentes do hipocampo, sugerindo uma associação funcional entre a restauração do ANV e ganhos cognitivos. Mecanisticamente, estes efeitos foram associados a uma redução da atividade de NADPH oxidase, sugerindo a atenuação da produção de radical superóxido e do potencial stress oxidativo local e a preservação da biodisponibilidade de •NO como principais contribuintes para os benefícios observados.Para aprofundar o estudo sobre a base molecular destes efeitos, foi realizada uma análise proteómica redox em amostras de hipocampo, com vista à identificação de alterações em vias sensíveis ao estado redox e potenciais proteínas críticas na modulação neurovascular e cognitiva observada. O estudo demonstrou que a suplementação com nitrato modula a abundância relativa de proteínas envolvidas nas vias vasculares e redox, bem como na função sináptica, incluindo componentes da neurotransmissão glutamatérgica e do metabolismo da glutationa, sugerindo que os efeitos do nitrato se estendem a mecanismos neuroprotetores associados à integridade sináptica e à homeostasia redox.Por último, é importante salientar que a suplementação com nitrato depende fortemente do estadio de progressão da doença diabética. Enquanto a administração na fase inicial da diabetes preservou eficazmente a função neurovascular e cognitiva, o início do tratamento em ratos GK adultos com disfunção neurovascular já estabelecida e comprometimento cognitivo notório resulta em benefícios limitados, sugerindo que as alterações estruturais e moleculares se tornam menos reversíveis com o tempo.