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Radionuclide therapy has been presenting an increasingly important role in cancer treatment. Radium dichloride (²²³RaCl₂) was the first predominantly alpha emitter approved for clinical use, specifically in the treatment of castration-resistant metastatic prostate cancer with bone exclusive metastases. However, its therapeutic efficacy remains limited and highly variable among patients due to insufficient understanding of the mechanisms of action and the heterogeneity of dose deposition, which are critical aspects for interpreting the biological response and clinical outcomes. In this context, our study aims to comprehensively investigate the cellular and subcellular dosimetry of ²²³RaCl₂, combining in vitro experimental approaches and in silico modeling to deepen our understanding of the response to alpha radiation in metastatic prostate cancer cell models. The research integrated three complementary aspects, namely the development of a three-dimensional (3D) model of tumor spheroids, cellular and molecular radiobiology studies, and computational modeling of cellular and subcellular dosimetry applied to experimental conditions. Thus, cellular and subcellular kinetic data, cellular characteristics, and irradiation system characteristics were integrated with computational microdosimetry tools to achieve a more accurate and translational characterization of dosimetry and the biological effects induced by exposure to ²²³RaCl₂.To reproduce tumor microarchitecture more realistically, a 3D model was developed and characterized based on the formation of homotypic spheroids from PC3 and LNCaP cell lines, representative of different metastatic stages of prostate cancer. The liquid overlay technique showed to be the most effective, producing compact, homogeneous, and reproducible spheroids suitable for studies with radiopharmaceuticals and compatible with radiation protection standards. These spheroids exhibited relevant tumor characteristics, including increased expression of epithelial-mesenchymal transition markers (N-cadherin and vimentin) and the presence of hypoxic and necrotic zones, reinforcing their value as a preclinical platform for alpha emitters. Radiobiological studies demonstrated a dose-dependent cytotoxic response, tumor architecture, and cell model, with higher radiosensitivity in LNCaP cell models (lymphatic metastases) and higher radioresistance in PC3 cell models (bone metastases). The type and duration of exposure, as well as the irradiation geometry, significantly influenced the results, highlighting the limitations of using the average absorbed dose as the sole metric in studies with alpha emitters. Molecular assays revealed that ²²³RaCl₂ induces direct DNA damage, activation of the ATM/CHK2/P53 pathways associated with cell cycle arrest, and predominantly apoptotic cell death. In addition, an increase in reactive oxygen species was observed, potentially implicated in local or systemic non-target effects. Differentiated modulation of DNA repair pathways was also observed, with homologous recombination (HR) repair being predominant after exposure to low doses and saturation of base excision repair (BER), HR, and non-homologous end joining (NHEJ) repair pathways after high doses. Exposure to ²²³RaCl₂ also induced inhibition of migration, invasion, and angiogenesis, associated with a significant reduction in ITGB1 and VIM expression. Computational modeling with MIRDcell integrated morphological and kinetic data, allowing the calculation of S-values and the simulation of spatial dose deposition simulation. The results demonstrated that the subcellular localization of activity and spatial heterogeneity condition the biological response and that the dose at specific targets is more informative than classical metrics based on total mass. In summary, this work presents an integrated, reproducible, and biologically relevant approach for evaluating the cellular and molecular effects of ²²³RaCl₂, contributing to the advancement of alpha emitter radiobiology. The 3D cell model and subcellular modeling developed are fundamental tools for standardizing non-clinical dosimetry, with high translational value. These results show the potential of ²²³RaCl₂ as a localized cytotoxic agent and, simultaneously, as a modulator of the metastatic microenvironment and tumor aggressiveness. These effects support the development of more selective, effective, and precision oncology-aligned next-generation alpha therapies.

O dicloreto de rádio (²²³RaCl₂) foi o primeiro emissor predominantemente alfa aprovado para utilização clínica, destinado ao tratamento por radionuclídeos de doentes com cancro da próstata metastático resistente à castração, com metástases ósseas e sem metástases viscerais. Contudo, a sua eficácia terapêutica permanece limitada e altamente variável entre doentes, devido à insuficiente compreensão dos mecanismos de ação e da heterogeneidade da deposição de dose, aspetos críticos para interpretar a resposta biológica e a resposta à terapêutica. Neste contexto, o nosso trabalho tem como objetivo estudar, de forma integrada, a dosimetria celular e subcelular do ²²³RaCl₂, combinando abordagens experimentais in vitro e modelação in silico para aprofundar o conhecimento da resposta à radiação alfa, em modelos celulares metastáticos de cancro da próstata. A investigação integra três vertentes complementares, tais como o desenvolvimento de um modelo tridimensional (3D) de esferoides tumorais, estudos de radiobiologia celular e molecular e a modelação computacional da dosimetria celular e subcelular aplicada às condições experimentais. Assim, dados de cinética celular e subcelular, características celulares e do sistema de irradiação foram integrados, com ferramentas de microdosimetria computacional, de modo a alcançar uma caracterização mais rigorosa e translacional da dosimetria e dos efeitos biológicos induzidos pela exposição ao ²²³RaCl₂.Para reproduzir de forma mais realista a microarquitetura tumoral, foi desenvolvido e caracterizado um modelo 3D baseado na formação de esferoides homotípicos das linhas celulares PC3 e LNCaP, representativas de diferentes estádios metastáticos de cancro da próstata. A técnica de sobreposição líquida revelou-se a mais eficaz, originando esferoides compactos, homogéneos e reprodutíveis, adequados para estudos com radiofármacos e compatíveis com as exigências de radioprotecção. Estes esferoides apresentaram características tumorais relevantes, incluindo expressão aumentada de marcadores transição epitélio-mesênquima (N-caderina e vimentina) e a presença de zonas hipóxicas e necróticas, o que reforça o seu valor como plataforma não-clínica para emissores alfa. Os estudos radiobiológicos demonstraram uma resposta citotóxica dependente da dose, da arquitetura tumoral e do modelo celular, com maior radiossensibilidade nos modelos de células LNCaP (metástases linfáticas) e maior radiorresistência em modelos de células PC3 (metástases ósseas). O tipo e a duração da exposição, bem como a geometria de irradiação, influenciaram significativamente os resultados, evidenciando as limitações da utilização da dose absorvida média como métrica única em estudos com emissores alfa. Os ensaios moleculares revelaram que o ²²³RaCl₂ induziu lesões diretas no DNA, ativação das vias ATM/CHK2/P53 associada ao bloqueio do ciclo celular e à ocorrência de morte predominantemente apoptótica. Adicionalmente, verificou-se um aumento de espécies reativas de oxigénio, potencialmente implicadas em efeitos não-alvo locais ou sistémicos. Observou-se ainda modulação diferenciada das vias de reparação do DNA, com a reparação por recombinação homóloga (HR) a ser predominante após exposição a baixas doses, e saturação das vias de reparação por excisão de bases (BER), HR e por junção de extremidades não homólogas (NHEJ) após doses elevadas. A exposição ao ²²³RaCl₂ induziu, também, inibição da migração, da invasão e da angiogénese, associada à redução significativa da expressão de ITGB1 e VIM. A modelação computacional com o MIRDcell integrou dados morfológicos e cinéticos, o que permitiu o cálculo de S-values e a simulação espacial da deposição da dose. Os resultados demonstraram que a localização subcelular da atividade e a heterogeneidade espacial condicionam a resposta biológica e que a dose nos alvos específicos é mais informativa do que métricas clássicas baseadas na massa total. Em suma, este trabalho apresenta uma abordagem integrada, reprodutível e biologicamente relevante para a avaliação dos efeitos celulares e moleculares do ²²³RaCl₂, contribuindo para o avanço da radiobiologia de emissores alfa. O modelo celular 3D e a modelação subcelular desenvolvidos constituem ferramentas fundamentais para a padronização da dosimetria não-clínica, de elevado valor translacional. O ²²³RaCl₂ demonstrou exercer um efeito citotóxico localizado e, simultaneamente, um efeito modulador do microambiente metastático e da agressividade tumoral. Estes efeitos apoiam o desenvolvimento de terapias alfa de próxima geração mais seletivas, eficazes e alinhadas com a oncologia de precisão.