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FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)

A peçonha ofídica é composta majoritariamente de proteínas, como as serinoproteases. Entre essas, especifica-se as serinoproteases thrombin-like, cujo efeito coagulante já foi comprovado, sendo assim, um possível fármaco para o tratamento de desregulações hemostáticas, como a Hemofilia. Desse modo, visou-se realizar a síntese e a caracterização funcional da serinoprotease thrombin-like recombinante (rSBP-I) da peçonha de Bothrops pauloensis, serpente típica do Cerrado brasileiro, expressa em Nicotiana benthamiana. Para a realização da síntesse da proteína de interesse fez-se a clonagem de colônias de E. coli DH5α, previamente transformadas com a sequência de genes referente a rSBP-I inserida no vetor pEAQ-HT, e posterior transformação por eletroporação de colônias de R. radiobacter EHA105 com o material genético de colônias de E. coli com transformação confirmada por PCR seguida de uma eletroforese em gel de agarose. Depois de confirmar a transformação das R. radiobacter, realizou-se a agroinfiltração com colônias bacterianas confirmadas na região abaxial de folhas de Nicotiana benthamiana por pressão de seringa. Cinco dias após a infiltração, realizou-se a coleta das folhas infiltradas e material selvagem (folhas de plantas não infiltradas). Posteriormente, fez-se a extração rpoteica dos materiais coletados, cujos extratos foram purificados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Tais materiais purificados foram dialisados, liofilizados e ressuspendidos, sendo posteriormente quantificados pelo método de Bradford, assim como os extratos proteicos. Para confirmar a expressão da rSBP-I, realizou-se o protocolo de Western Blotting tanto dos extratos quanto dos materiais purificados. De modo a determinar a funcionalidade parcial da rSBP-I expressa, analisou-se a Atividade Fibrinogenolítica da proteína com variação de tempo de reação. Ao final do estudo, foi detectada uma proteína presente no material extraido das folhas infiltradas com a construção rBPSP-I e ausente no material controle. Entretanto a massa molecular observada é inferior a massa teórica esperada, fazendo com que não fosse possível afirmar que proteína recombinante de interesse foi produzida em plantas de Nicotiana benthamiana infiltradas. Foi possível observar um efeito fibrinogenolítico em extratos proteicos de folhas infiltradas no tratamento de 60 minutos quando comparado ao material controle. Estudos posteriores deverão ser realizados para a confirmação da identidade da proteína expressa.