Document details

Bone tissue is a complex and dynamic structure composed of a mineralized extracellular matrix, where osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts interact in a coordinated manner to regulate matrix formation, maintenance, and resorption, thereby ensuring the bone homeostasis. Tissue engineering has long sought to reproduce the structure and physiology of human bone in vitro; however, existing models still fail to fully replicate the dynamic development, regeneration and remodelling processes arising from the structural and functional complexity of this tissue. In this context, this thesis proposes the development of an innovative bioengineering unit capable of generating next generation autonomous, dynamic, and controllable bone microtissues. Liquid core capsules with a hydrogel-like shell composed by the coordination of gelatine chemically functionalized with the catechol analogue hydroxypyridinone (GH) with iron, were employed, forming biocompatible, scalable, and semipermeable units that support long-term cell culture. GH capsules were combined with dopamine-modified gelatine (GD), leveraging its ability to chelate calcium ions and enhance mineralization, resulting in liquefied GH+GD microcapsules. The monoculture of human bone marrow–derived mesenchymal stromal cells (BM-hMSCs) within these capsules for 21 days promoted osteogenic differentiation in the absence of exogenous osteogenic inducers, leading to the formation of osteoblast cells, deposition of mineralized extracellular matrix, and osteoclastogenic potential. The co-culture of BM hMSCs and THP-1 monocytes for 35 days in GH+GD microcapsules, revealed the presence of functional osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts capable of coordinating extracellular matrix production and resorption, maintaining a physiological balance consistent with bone remodelling. The supramolecular properties of GH capsules further confer self-healing behaviour, allowing spatial and temporal control of the inner microenvironment and its long-term storage. The ability to create a second inner environment with the injection of E3-type peptide amphiphiles (PA-E3) into GH capsules and controlled in situ self assembly, enabled the formation of highly organized nanofibrous microarchitectures, with strong potential for hydroxyapatite nucleation. The formation kinetics and spatial distribution were controlled by Ca²⁺ exposure, mimicking the bone’s nanoarchitecture. In summary, this thesis presents GH+GD liquefied capsules as a versatile bioengineering strategy to create functional, programmable, and autonomous in vitro bone micromodels. The system was shown to be bioactive, allowing spatiotemporal control of the inner microenvironment, and supporting structures that mimic bone development, remodelling and nanoarchitecture. This may, represent an advance for biomimetic strategies in large-scale bone tissue engineering and regeneration.

O tecido ósseo é uma estrutura complexa e dinâmica composta por uma matriz extracelular mineralizada, onde osteoblastos, osteócitos e osteoclastos interagem de forma coordenada para regular a formação, manutenção e reabsorção da matriz, assegurando a homeostasia do osso. A engenharia de tecidos tem procurado reproduzir in vitro a estrutura e fisiologia do osso humano; contudo, os modelos existentes ainda não conseguem replicar plenamente os processos dinâmicos de desenvolvimento, regeneração remodelação que resultam da complexidade estrutural e funcional deste tecido. Neste contexto, esta tese propõe o desenvolvimento de uma unidade de bioengenharia inovadora capaz de gerar microtecidos ósseos autónomos, dinâmicos e controláveis de última geração. Cápsulas de núcleo líquido, revestidas por uma camada tipo hidrogel formada pela coordenação entre gelatina funcionalizada com hidroxipiridinona (GH) e ferro, foram utilizadas, formando unidades biocompatíveis, escaláveis e semipermeáveis, adequadas ao cultivo celular prolongado. As cápsulas GH foram combinadas com gelatina modificada com dopamina (GD), aproveitando a sua capacidade de captar iões cálcio e favorecer a mineralização, resultando em microcápsulas liquefeitas de GH+GD. A monocultura de células estaminais mesenquimais humanas derivadas da medula óssea (BM-hMSCs) nestas cápsulas durante 21 dias promoveu diferenciação osteogénica na ausência de indutores osteogénicos exógenos, com formação de osteoblastos, deposição de matriz extracelular mineralizada e potencial osteoclastogénico. A co-cultura de BM-hMSCs e monócitos THP-1 durante 35 dias em microcápsulas GH+GD, revelou a presença de osteoblastos, osteócitos e osteoclastos funcionalmente ativos, capazes de produzir e reabsorver a matriz extracelular de forma coordenada, mantendo um equilíbrio fisiológico compatível com a remodelação óssea. As propriedades supramoleculares das cápsulas GH conferem ainda um comportamento de autorreparação, permitindo o controlo espacial e temporal do microambiente interno da cápsula e o seu armazenamento a longo prazo. A capacidade de criar um segundo ambiente interno com a injeção de peptídeos anfifílicos tipo E3 (PA-E3) em cápsulas GH e a auto-montagem controlada in situ, permitiu gerar microarquiteturas nanofibrilares altamente organizadas, com elevado potencial para nucleação de hidroxiapatite. A cinética e distribuição espacial foram controladas pela exposição ao Ca²⁺, mimetizando a nanoarquitetura do osso. Em suma, esta tese apresenta as cápsulas liquefeitas GH e GH+GD como uma estratégia de bioengenharia versátil para criar micromodelos ósseos in vitro funcionais, programáveis e autónomos. O sistema demonstrou ser bioativo, permitindo o controlo espácio-temporal do microambiente interno, e suportando estruturas que mimetizam o desenvolvimento, a remodelação e a nanoarquitectura óssea. Isto pode representar um avanço para estratégias biomiméticas de engenharia e regeneração de tecidos ósseos em larga escala.