Quantification of metabolites of kinureninergic pathway and inflammatory biomarkers in biological samples of cardiac patients with heart failure: an exploratory pilot study - Sousa, Ana Catarina Pinto de (2020)
O triptofano (TRP) tem um papel importante na síntese de proteínas e de várias substâncias biologicamente ativas. É metabolizado pela via da quinurenina, produzindo uma série de metabolitos ativos tais como o ácido quinurénico (KA), L-quinurenina (KYN), entre outros. Os metabolitos do TRP estão relacionados com processos biológicos como a inflamação, a excitabilidade neuronal, o crescimento celular, o stress oxidativo e a divisão celular. Além disso, existem evidências recentes que indicam que os metabolitos do TRP desempenham um papel relevante na fisiopatologia das doenças cardiovasculares através de mecanismos inflamatórios e de stress oxidativo. A quantificação do TRP e dos seus metabolitos em amostras biológicas pode ser uma poderosa ferramenta para compreender os mecanismos da doença. Assim sendo, é de suma importância desenvolver métodos analíticos capazes de quantificar o TRP e seus metabolitos para que juntamente com parâmetros bioquímicos e marcadores inflamatórios seja possível monitorizar a progressão da doença, sendo também útil em medicina forense. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a validação de um método analítico de cromatografia líquida com detetor UV-Vis e fluorescência (FD) (LC-UV-Vis/FD) para análise do TRP, KYN e KA em amostras de urina de doentes com insuficiência cardíaca (IC). Além disso, foram quantificados parâmetros bioquímicos e marcadores inflamatórios utilizando um analisador automático Prestige 24i e um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) que foi utilizado para a determinação dos níveis plasmáticos do peptídeo natriurético do cérebro (BNP) correlacionando os dados com os valores do TRP e dos seus metabolitos. As condições otimizadas do método LC-UV-Vis/FD foram conseguidas utilizando uma coluna analítica, Luna® 3 µm PFP, uma fase móvel constituída por 20 mM de formato de amónia em água ultra pura (com 0,01 % de ácido fórmico), acetonitrilo e etanol (95/2/3, v/v/v), um fluxo de 0,7 mL/min e uma temperatura de 25ºC no forno de coluna. Foi utilizado um programa de comprimento de onda (λ) para o detetor de UV fixado a 365 nm para a KYN e para a 3-nitrotirosina utilizada como padrão interno, e 344 nm para o KA. Para o detetor FD foi utilizado λ de excitação e emissão de 280 nm e 365 nm, respetivamente para o TRP. O método foi validado de acordo com as normas da European Medicines Agency (EMA) em termos de seletividade, linearidade, limite de deteção (LD), limite de quantificação (LQ), precisão, exatidão e recuperação. Os coeficientes de correlação (R2) foram superiores a 0,99 para todos os compostos. Os LD variaram entre 13,1 µg/mL para KYN e 21,6 µg/mL para TRP e KA. Os LQs foram de 39,8, 65,4 e 83,5 µg/mL para KYN, TRP e KA, respetivamente. O método demonstrou ser exato (82 a 116%) e preciso (abaixo de 15%) e as recuperações variaram entre 95 e 130%. O método foi aplicado para a quantificação do TRP e dos seus metabolitos em voluntários saudáveis e pacientes homens com IC. Os pacientes foram divididos em dois grupos, diabéticos (DM2/HF) e não diabéticos (HF). A concentração do TRP e dos seus metabolitos foram comparadas entre grupos. Os resultados mostraram que o grupo DM2/HF apresentou valores medianos de KYN mais elevados e KA mais baixos do que os voluntários saudáveis. Pelo contrário, foram encontrados valores medianos mais baixos destes metabolitos no grupo HF do que os dos pacientes DM2/HF e voluntários. As razões KYN/TRP e KA/KYN também foram determinadas. Os resultados apoiam a hipótese de que a razão KYN/TRP está relacionada com a atividade enzimática e que a razão KA/KYN pode ser um bom indicador neuroprotetor. Apesar dos dados do presente estudo terem sido obtidos a partir de um pequeno grupo de pacientes (estudo piloto), os resultados mostraram uma relação entre parâmetros bioquímicos, marcadores inflamatórios e alterações na concentração de TRP, KYN e KA e o potencial do método LC-UV-Vis/FD para a monitorização dos compostos selecionados em pacientes cardíacos.