Publicação
Structure-function studies of the carboxylic acid transporter Mae1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae
| Resumo: | As proteínas transportadoras de membrana têm um papel de relevo na otimização das fábricas celulares microbianas mediando o importe de fontes de carbono e energia, assim como o exporte de metabolitos de interesse. Apesar da sua crescente relevância, a engenharia de proteínas transportadoras está ainda numa fase inicial, uma vez que o conhecimento sobre os mecanismos de transporte de solutos permanece limitado devido à complexidade da caraterização funcional e estrutural das proteínas de membrana. A proteína Mae1 de Schizosaccharomyces pombe pertence à família dos transportadores de dicarboxilato resistentes ao telurito (TDT). Mae1 foi inicialmente descrita como um importador de malato e succinato, do tipo simporte com protões, promovendo a acumulação intracelular de dicarboxilatos. Estudos posteriores demonstraram que este transportador é também capaz de promover o exporte destes substratos, uma vez que a sua expressão em estirpes produtoras de ácidos carboxílicos promove a produção de ácido succínico, málico e fumárico. Neste trabalho utilizámos uma combinação de abordagens in silico para previsão da estrutura 3D e ancoragem molecular do Mae1, com vista a um aumento do conhecimento sobre este transportador. Dezassete resíduos de aminoácidos foram selecionados para mutagénese tendo por base a previsão de interações com substrato, o estado de conservação na família TDT e a localização na zona interna do poro do transportador. Os alelos de Mae1 foram expressos nas estirpes Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D e S. cerevisiae IMK982 para avaliação da capacidade de crescimento em diferentes fontes de carbono. A expressão de Mae1 na estirpe CEN.PK113-5D promoveu uma diminuição do crescimento em meio contento ácidos carboxílicos, enquanto que na estirpe IMK982, que não possui transportadores de carboxilatos, promoveu um aumento. Este fenótipo sugere que este transportador atua de forma distinta nas duas estirpes de S. cerevisiae. A expressão dos alelos mutantes de Mae1 promoveu a alteração do fenótipo de crescimento, comparativamente com o alelo selvagem, sugerindo uma alteração da atividade do transportador. A futura caracterização funcional e determinação da localização subcelular dos alelos mutantes permitirá a determinação do efeito das diferentes mutações na atividade deste transportador. |
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| Autores principais: | Fontes, Tayane Trindade |
| Assunto: | Ácidos carboxílicos Ancoragem molecular proteína-ligando Mutagénese dirigida Transportadores de membrana Carboxylic acids Molecular docking Membrane transporters Mutagenesis Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | português |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | As proteínas transportadoras de membrana têm um papel de relevo na otimização das fábricas celulares microbianas mediando o importe de fontes de carbono e energia, assim como o exporte de metabolitos de interesse. Apesar da sua crescente relevância, a engenharia de proteínas transportadoras está ainda numa fase inicial, uma vez que o conhecimento sobre os mecanismos de transporte de solutos permanece limitado devido à complexidade da caraterização funcional e estrutural das proteínas de membrana. A proteína Mae1 de Schizosaccharomyces pombe pertence à família dos transportadores de dicarboxilato resistentes ao telurito (TDT). Mae1 foi inicialmente descrita como um importador de malato e succinato, do tipo simporte com protões, promovendo a acumulação intracelular de dicarboxilatos. Estudos posteriores demonstraram que este transportador é também capaz de promover o exporte destes substratos, uma vez que a sua expressão em estirpes produtoras de ácidos carboxílicos promove a produção de ácido succínico, málico e fumárico. Neste trabalho utilizámos uma combinação de abordagens in silico para previsão da estrutura 3D e ancoragem molecular do Mae1, com vista a um aumento do conhecimento sobre este transportador. Dezassete resíduos de aminoácidos foram selecionados para mutagénese tendo por base a previsão de interações com substrato, o estado de conservação na família TDT e a localização na zona interna do poro do transportador. Os alelos de Mae1 foram expressos nas estirpes Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D e S. cerevisiae IMK982 para avaliação da capacidade de crescimento em diferentes fontes de carbono. A expressão de Mae1 na estirpe CEN.PK113-5D promoveu uma diminuição do crescimento em meio contento ácidos carboxílicos, enquanto que na estirpe IMK982, que não possui transportadores de carboxilatos, promoveu um aumento. Este fenótipo sugere que este transportador atua de forma distinta nas duas estirpes de S. cerevisiae. A expressão dos alelos mutantes de Mae1 promoveu a alteração do fenótipo de crescimento, comparativamente com o alelo selvagem, sugerindo uma alteração da atividade do transportador. A futura caracterização funcional e determinação da localização subcelular dos alelos mutantes permitirá a determinação do efeito das diferentes mutações na atividade deste transportador. |
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