Publicação
Yeast as a model system for the study of carboxylic acid transporters
| Resumo: | Os transportadores de membrana de ácidos carboxílicos desempenham papéis cruciais nas indústrias biotecnológicas emergentes, ao aumentar a eficiência das fábricas celulares microbianas produtoras de diversos produtos químicos de plataforma, relevantes para vários setores industriais. A utilização de proteínas transportadoras, exportadores e importadores, permite ultrapassar problemas importantes na produção biológica, tais como a acumulação de produtos intracelulares, aumentando o seu exporte, além de fornecer uma maneira eficiente de promover e regular a entrada de substratos. Neste trabalho, o estudo de transportadores de membrana foi realizado através da sua expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. Uma dessas investigações resultou na expansão da gama de substratos para Ato1, um transportador de acetato de S. cerevisiae. Mutações na região FLY (F98A e L219A/S/G/V), o local de constrição mais estreito do transportador, melhoraram significativamente o crescimento em ácido lático e permitiram o crescimento em ácido succínico, ampliando sua especificidade de substrato. A mutação E144A aumentou a sensibilidade ao ácido acético. Noutro trabalho foram identificados e caracterizados dezasseis transportadores de carboxilatos da levedura Cyberlindnera jadinii tendo o CjAto5, CjJen6, CjSlc5 e CjSlc13-1 exibido a gama mais ampla de substratos. A conservação da região de constrição FLY de CjAto foi fundamental para a especificidade do transportador, tal como no Ato1, também membro da família AceTr. Estudos filogenéticos, previsões de estrutura 3D e ancoragem molecular ajudaram a entender a dinâmica funcional desses transportadores. A caracterização dos exportadores CexA (citrato) e Dct-02 (malato e succinato) de Aspergillus niger também foi realizada neste trabalho. A reconstrução filogenética das famílias DHA1 e TDT, juntamente com previsões estruturais 3D e estudos de ancoragem molecular, orientou a seleção de resíduos para mutagénese dirigida. O transportador CexA é capaz de importar citrato com baixa afinidade por difusão facilitada. As mutações P200A, Y307A, S315A e R461A prejudicaram o transporte de citrato. Os resíduos R192 e Q196 estão envolvidos no exporte de citrato, mas não afetam o importe. A expressão heteróloga de alelos de DCT02 em S. cerevisiae revelou mutações (R59E, R59L e T136S) que diminuíram o crescimento em ácidos carboxílicos, comparado com células que expressavam o Dct-02, sugerindo um aumento de exporte. Os mutantes R114A, R114H, E130A, P204A, L210A, R255A, G275A, F279A, F279H, F279Q e F353A estão associados a fenótipos de perda de função. Análises de dinâmica molecular do CexA e Dct-02 calcularam os perfis de energia livre, suportando o papel de alguns resíduos no reconhecimento do substrato, e identificaram um novo local de ligação ao citrato no CexA. Estas abordagens forneceram informações sobre a complexidade estrutural dos transportadores de membrana, com ênfase nos exportadores. |
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| Autores principais: | Alves, João Fernando Machado |
| Assunto: | Ácidos carboxílicos Fábricas celulares microbianas Transportadores de membrana Análise estrutura-função Bioinformática Carboxylic acid Microbial cell factories Membrane transporters Structure-function analysis Bioinformatics Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | tese de doutoramento |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | Os transportadores de membrana de ácidos carboxílicos desempenham papéis cruciais nas indústrias biotecnológicas emergentes, ao aumentar a eficiência das fábricas celulares microbianas produtoras de diversos produtos químicos de plataforma, relevantes para vários setores industriais. A utilização de proteínas transportadoras, exportadores e importadores, permite ultrapassar problemas importantes na produção biológica, tais como a acumulação de produtos intracelulares, aumentando o seu exporte, além de fornecer uma maneira eficiente de promover e regular a entrada de substratos. Neste trabalho, o estudo de transportadores de membrana foi realizado através da sua expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. Uma dessas investigações resultou na expansão da gama de substratos para Ato1, um transportador de acetato de S. cerevisiae. Mutações na região FLY (F98A e L219A/S/G/V), o local de constrição mais estreito do transportador, melhoraram significativamente o crescimento em ácido lático e permitiram o crescimento em ácido succínico, ampliando sua especificidade de substrato. A mutação E144A aumentou a sensibilidade ao ácido acético. Noutro trabalho foram identificados e caracterizados dezasseis transportadores de carboxilatos da levedura Cyberlindnera jadinii tendo o CjAto5, CjJen6, CjSlc5 e CjSlc13-1 exibido a gama mais ampla de substratos. A conservação da região de constrição FLY de CjAto foi fundamental para a especificidade do transportador, tal como no Ato1, também membro da família AceTr. Estudos filogenéticos, previsões de estrutura 3D e ancoragem molecular ajudaram a entender a dinâmica funcional desses transportadores. A caracterização dos exportadores CexA (citrato) e Dct-02 (malato e succinato) de Aspergillus niger também foi realizada neste trabalho. A reconstrução filogenética das famílias DHA1 e TDT, juntamente com previsões estruturais 3D e estudos de ancoragem molecular, orientou a seleção de resíduos para mutagénese dirigida. O transportador CexA é capaz de importar citrato com baixa afinidade por difusão facilitada. As mutações P200A, Y307A, S315A e R461A prejudicaram o transporte de citrato. Os resíduos R192 e Q196 estão envolvidos no exporte de citrato, mas não afetam o importe. A expressão heteróloga de alelos de DCT02 em S. cerevisiae revelou mutações (R59E, R59L e T136S) que diminuíram o crescimento em ácidos carboxílicos, comparado com células que expressavam o Dct-02, sugerindo um aumento de exporte. Os mutantes R114A, R114H, E130A, P204A, L210A, R255A, G275A, F279A, F279H, F279Q e F353A estão associados a fenótipos de perda de função. Análises de dinâmica molecular do CexA e Dct-02 calcularam os perfis de energia livre, suportando o papel de alguns resíduos no reconhecimento do substrato, e identificaram um novo local de ligação ao citrato no CexA. Estas abordagens forneceram informações sobre a complexidade estrutural dos transportadores de membrana, com ênfase nos exportadores. |
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