Publicação
Desenvolvimento de um novo método de quantificação molecular com base em qPCR para estudo da vaginose bacteriana
| Resumo: | A vaginose bacteriana (VB) é uma condição comum que afeta mulheres na idade reprodutiva, sendo marcada por um decréscimo de bactérias produtoras de ácido lático, normalmente do género Lactobacillus spp., o que consequentemente favorece o crescimento de bactérias anaeróbias obrigatórias ou facultativas. Os métodos de diagnóstico mais utilizados para a VB são nomeadamente, o método de Amsel (método clínico) e o método de Nugent (método laboratorial), porém, ambos o métodos apresentam limitações. Tendo isto em conta, o objetivo principal deste estudo debruçou-se no desenvolvimento de um potencial novo método molecular para futura aplicação no diagnóstico para VB. Para atingir este objetivo, foi necessário proceder à realização de curvas de calibração para 3 espécies, G.vaginalis, F.vaginae e P.bivia, frequentemente associadas à formação de biofilme em casos positivos para esta condição. Para tal, primeiramente foi adicionado controlo exógeno às suspensões bacterianas, uma suspensão de E.coli, de modo a normalizar as perdas bacterianas que correm durante a extração e proporcionar uma melhor quantificação bacteriana. As curvas de calibração construídas demonstraram uma boa relação entre quantidade bacteriana e quantidade de gDNA extraído, tanto para amostras de suspensões bacterianas como para amostras de suspensões de biofilmes, numa faixa entre as 1×108 células/mL e 1×103 células/mL. A precisão das curvas foi avaliada pela realização de mock cultures, as quais aferiram a inexistência de erros significativos em amostras a altas concentrações (108 células/mL) e a baixas concentrações (103 células/mL). Adicionalmente, os ensaios de desenvolvimento de biofilme com recurso às curvas de calibração, revelaram-se úteis para avaliar a evolução das 3 bactérias ao longo do tempo, relatando-se uma maior constituição de G.vaginalis, seguida por F.vaginae e por fim P.bivia. Em suma, os resultados obtidos demonstraram que a estratégia escolhida para construir curvas de calibração contendo um normalizador externo, podem servir como um bom método de diagnóstico para a VB, sendo necessário realizar estudos futuros, nomeadamente na vertente de testar as curvas para amostras vaginais, uma vez que os estudos in vitro não mimetizam a complexa diversidade da microbiota vaginal in vivo. |
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| Autores principais: | Pinto, Ana Sofia Gonçalo |
| Assunto: | Biofilmes Controlo exógeno Curvas de calibração Diagnóstico Fannyhessea vaginae Gardnerella vaginalis Prevotella bivia qPCR Vaginose bacteriana Bacterial vaginosis Biofilms Calibration curves Diagnosis Exogenous control Engenharia e Tecnologia |
| Ano: | 2023 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | português |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | A vaginose bacteriana (VB) é uma condição comum que afeta mulheres na idade reprodutiva, sendo marcada por um decréscimo de bactérias produtoras de ácido lático, normalmente do género Lactobacillus spp., o que consequentemente favorece o crescimento de bactérias anaeróbias obrigatórias ou facultativas. Os métodos de diagnóstico mais utilizados para a VB são nomeadamente, o método de Amsel (método clínico) e o método de Nugent (método laboratorial), porém, ambos o métodos apresentam limitações. Tendo isto em conta, o objetivo principal deste estudo debruçou-se no desenvolvimento de um potencial novo método molecular para futura aplicação no diagnóstico para VB. Para atingir este objetivo, foi necessário proceder à realização de curvas de calibração para 3 espécies, G.vaginalis, F.vaginae e P.bivia, frequentemente associadas à formação de biofilme em casos positivos para esta condição. Para tal, primeiramente foi adicionado controlo exógeno às suspensões bacterianas, uma suspensão de E.coli, de modo a normalizar as perdas bacterianas que correm durante a extração e proporcionar uma melhor quantificação bacteriana. As curvas de calibração construídas demonstraram uma boa relação entre quantidade bacteriana e quantidade de gDNA extraído, tanto para amostras de suspensões bacterianas como para amostras de suspensões de biofilmes, numa faixa entre as 1×108 células/mL e 1×103 células/mL. A precisão das curvas foi avaliada pela realização de mock cultures, as quais aferiram a inexistência de erros significativos em amostras a altas concentrações (108 células/mL) e a baixas concentrações (103 células/mL). Adicionalmente, os ensaios de desenvolvimento de biofilme com recurso às curvas de calibração, revelaram-se úteis para avaliar a evolução das 3 bactérias ao longo do tempo, relatando-se uma maior constituição de G.vaginalis, seguida por F.vaginae e por fim P.bivia. Em suma, os resultados obtidos demonstraram que a estratégia escolhida para construir curvas de calibração contendo um normalizador externo, podem servir como um bom método de diagnóstico para a VB, sendo necessário realizar estudos futuros, nomeadamente na vertente de testar as curvas para amostras vaginais, uma vez que os estudos in vitro não mimetizam a complexa diversidade da microbiota vaginal in vivo. |
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