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Novel therapeutic options for chemotherapy- resistant triple negative breast cancer
| Summary: | O cancro da mama triplo negativo (CMTN) é considerado o subtipo de cancro da mama mais agressivo, representando 10-20 % dos casos de cancro da mama com uma natureza altamente invasiva e metastática, e os piores prognósticos. As opções terapêuticas contra o CMTN são limitadas e ineficientes perante a quimiorresistência. A identificação e compreensão dos mecanismos e fatores genéticos determinantes da quimiorresistência são essenciais para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, constituindo o ponto focal desta tese. Para tal, sub-linhas celulares resistentes à doxorrubicina, DOX-MDA-MB-231 e DOX-MDA-MB-468, foram desenvolvidas. Os fatores de resistência foram avaliados para validar as sub-linhas resistentes como modelos pré-clínicos para estudos in vitro. Para realizar uma pesquisa no genoma completo de genes ligados à resistência à doxorrubicina, um sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-Cas9 com uma biblioteca de RNAs guia foi implementado em células do CMTN através de um vetor lentiviral, com vista a futuros sequenciamentos de alto rendimento. O NUPR1 foi identificado como um gene alvo candidato e a sua influência na aquisição de resistência à doxorrubicina em CMTN foi investigada. Inicialmente, duas construções CRISPR-Cas9, NUPR1-sgRNA1 e NUPR1-sgRNA2, foram desenhadas e transfetadas em células de CMTN para efetuar o silenciamento do NUPR1. A eficiência da edição genómica foi confirmada através de sequenciação de última geração, seguida de análises RT-qPCR. Os efeitos do silenciamento do NUPR1 foram avaliados por ensaios de ciclo celular, proliferação e cicatrização. Os resultados demonstraram uma retenção de células na fase G0/G1 do ciclo celular e uma diminuição de proliferação celular, sem ter sido detetada qualquer alteração na migração celular. Por fim, este trabalho evidenciou a sensibilização à doxorrubicina de células do CMTN geneticamente modificadas, comprovando a implicação do NUPR1 na quimiorresistência. Em suma, esta dissertação demonstra o potencial da utilização de tecnologias de edição genética na investigação do cancro e identifica o NUPR1 como um alvo genético promissor para novas terapias contra o CMTN resistente à quimioterapia. |
|---|---|
| Main Authors: | Sousa, Mariana Martins |
| Subject: | Cancro da mama CRISPR-Cas9 Doxorrubicina Quimiorresistência Breast cancer Chemoresistance Doxorubicin Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias |
| Year: | 2025 |
| Country: | Portugal |
| Document type: | master thesis |
| Access type: | embargoed access |
| Associated institution: | Universidade do Minho |
| Language: | English |
| Origin: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Summary: | O cancro da mama triplo negativo (CMTN) é considerado o subtipo de cancro da mama mais agressivo, representando 10-20 % dos casos de cancro da mama com uma natureza altamente invasiva e metastática, e os piores prognósticos. As opções terapêuticas contra o CMTN são limitadas e ineficientes perante a quimiorresistência. A identificação e compreensão dos mecanismos e fatores genéticos determinantes da quimiorresistência são essenciais para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, constituindo o ponto focal desta tese. Para tal, sub-linhas celulares resistentes à doxorrubicina, DOX-MDA-MB-231 e DOX-MDA-MB-468, foram desenvolvidas. Os fatores de resistência foram avaliados para validar as sub-linhas resistentes como modelos pré-clínicos para estudos in vitro. Para realizar uma pesquisa no genoma completo de genes ligados à resistência à doxorrubicina, um sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-Cas9 com uma biblioteca de RNAs guia foi implementado em células do CMTN através de um vetor lentiviral, com vista a futuros sequenciamentos de alto rendimento. O NUPR1 foi identificado como um gene alvo candidato e a sua influência na aquisição de resistência à doxorrubicina em CMTN foi investigada. Inicialmente, duas construções CRISPR-Cas9, NUPR1-sgRNA1 e NUPR1-sgRNA2, foram desenhadas e transfetadas em células de CMTN para efetuar o silenciamento do NUPR1. A eficiência da edição genómica foi confirmada através de sequenciação de última geração, seguida de análises RT-qPCR. Os efeitos do silenciamento do NUPR1 foram avaliados por ensaios de ciclo celular, proliferação e cicatrização. Os resultados demonstraram uma retenção de células na fase G0/G1 do ciclo celular e uma diminuição de proliferação celular, sem ter sido detetada qualquer alteração na migração celular. Por fim, este trabalho evidenciou a sensibilização à doxorrubicina de células do CMTN geneticamente modificadas, comprovando a implicação do NUPR1 na quimiorresistência. Em suma, esta dissertação demonstra o potencial da utilização de tecnologias de edição genética na investigação do cancro e identifica o NUPR1 como um alvo genético promissor para novas terapias contra o CMTN resistente à quimioterapia. |
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