Deciphering Human-microbiome glyco-code: An integrative approach to uncover protein-glycan interactions in the gut environment - Costa, Raquel Lopes (2023)
O microbioma humano é uma comunidade complexa de microorganismos que estão envolvidos em vários processos biológicos do hospedeiro. A bactéria Bacteroides thetaiotaomicron é altamente adaptável, alterando as preferências metabólicas de acordo com os glicanos complexos que estão disponíveis no intestino. O genoma desta espécie contém sistemas complexos, com genes co-regulados, designados Polysaccharide Utilization Loci (PUL) que codificam proteínas, tais como módulos de ligação a hidratos de carbono (CBMs), SusDs e enzimas modulares, com especificidade para um determinado glicano. Esta bactéria, tem a particularidade de expressar uma diversidade de PULs que previsívelmente degradam glicanos do hospedeiro, tais como O-glicanos de mucinas, glicoproteínas constituintes da mucosa intestinal que proteje o epitélio. A sua degradação excessiva pode levar à danificação da mucosa intestinal, facilitando a entrada de patógenos e doenças inflamatórias. O trabalho desenvolvido nesta Tese pretendeu contribuir para o estudo do reconhecimento de O-glicanos do hospedeiro por estes PULs a nível molecular, que é ainda vago, e focou para este fim em proteínas do PUL que direccionam o sistema para o substrato (CBMs anotados na família 32, CBM32), ou para importe no periplasma (proteínas do tipo SusD). Utilizando a tecnologia dos microarrays de glicanos, foram identificadas especificidades de ligação únicas para os CBMs a motivos presentes em O-glicanos, sendo o terminal não redutor galactose o monossacárido comum reconhecido: sequências do tipo LacNAc (Galβ1-4/3GlcNAc-) e LacDiNAc (GalNAcβ1-4GlcNAc-) para o BT0865-CBM, core 1 (Galβ1-3GalNAcαSer/Thr) e core 2 (GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαSer/Thr) para o BT3015C-CBM e Lewisa (Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-) para o BT4040-CBM. Tendo em conta a novidade dos glicanos reconhecidos, os CBMs BT3015C e BT4040 foram selecionados para caracterização estrutural por Cristalografia de raios-X e posterior análise da interação com o ligando. A estrutura 3D do BT3015C-CBM em complexo com core-1 e core-2 O-glicanos revelou um local de ligação canónico para a galactose e os amino ácidos Asn59, Asn89 and Asp147 em loops variáveis adjacentes a conferir especifidade para o ligando. A estrutura 3D da proteína SusD BT3013 do mesmo PUL, permitiu identificar uma região variável de loops com vários amino ácidos aromáticos, que podem constituir um sítio de ligação putativo. A caracterização estrutural do BT4040-CBM e de mutantes funcionais, identificou o trissacárido de Lewisa como motivo mínimo necessário para o reconhecimento e o amino ácido Glu73 como determinante da especificidade para o ligando fucosilado. A caracterização destes complexos de proteínas do B. thetaiotaomicron com o glicano alvo é essencial para perceber o metabolismo de glicanos por esta bactéria e seu o impacto no hospedeiro, conhecimento que pode ser usado no melhoramento estratégico da saúde do trato gastro-intestinal.