Publicação
Implementação de uma estratégia de validação de novos alvos terapêuticos em Mycobacterium tuberculosis por CRISPRi
| Resumo: | A tuberculose (TB), uma das principais doenças infeciosas provocadas por um único agente etiológico, permanece como ameaça à saúde pública global, apresentando ao longo das últimas décadas elevada morbilidade e mortalidade. Os seus regimes terapêuticos são morosos e com eficácia limitada, devido em parte à resistência intrínseca e ao desenvolvimento de resistência adquirida aos agentes antimicrobianos. Desta forma, persiste a necessidade de desenvolver novos fármacos anti-TB mais eficazes e seguros. O objetivo principal deste trabalho é validar novos alvos terapêuticos em Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) através da aplicação da metodologia de repetições palindrómicas curtas agrupadas e regularmente intercaladas (CRISPR) de interferência (CRISPRi) e caracterizar o efeito da repressão nos genes identificados, através da avaliação do crescimento e viabilidade bacteriana. Inicialmente, implementou-se a metodologia em Mycobacterium smegmatis mc2155 (M. smegmatis) utilizando o gene inhA como alvo, que através de ensaios de determinação de concentração mínima inibitória (CMI) de anidrotetraciclina (ATc) e spot plating, demonstrou ser vulnerável à indução (CMI ≤ 0.78 µg/mL) e essencial ao crescimento e viabilidade bacteriana. Posteriormente, treze genes selecionados para M. tuberculosis - efp, ask, thiC, rpIR, infA, asd, ftsX, rpIN, aroF, fadD32, ino1, prpC e Rv2050 – que evidenciaram estar sob pressão seletiva purificante e restrição mutacional, foram utilizados como alvos de CRISPRi, que demonstrou a invulnerabilidade à inibição e não essencialidade dos genes prpC e Rv2050 no crescimento e viabilidade da micobactéria. Pelo contrário, validou-se preliminarmente os genes efp, ask, thiC, rpIR, infA, asd, ftsX, rpIN, aroF, fadD32 e ino1 como potenciais novos alvos terapêuticos no combate à TB, uma vez que demonstraram vulnerabilidade à inibição e essencialidade no crescimento e viabilidade bacteriana. |
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| Autores principais: | Mora, Diana da Conceição Lagoa |
| Assunto: | CRISPRI Tuberculose Vulnerabilidade Essencialidade Mycobacterium tuberculosis Teses de mestrado - 2025 |
| Ano: | 2025 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Lisboa |
| Idioma: | português |
| Origem: | Repositório da Universidade de Lisboa |
| Resumo: | A tuberculose (TB), uma das principais doenças infeciosas provocadas por um único agente etiológico, permanece como ameaça à saúde pública global, apresentando ao longo das últimas décadas elevada morbilidade e mortalidade. Os seus regimes terapêuticos são morosos e com eficácia limitada, devido em parte à resistência intrínseca e ao desenvolvimento de resistência adquirida aos agentes antimicrobianos. Desta forma, persiste a necessidade de desenvolver novos fármacos anti-TB mais eficazes e seguros. O objetivo principal deste trabalho é validar novos alvos terapêuticos em Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) através da aplicação da metodologia de repetições palindrómicas curtas agrupadas e regularmente intercaladas (CRISPR) de interferência (CRISPRi) e caracterizar o efeito da repressão nos genes identificados, através da avaliação do crescimento e viabilidade bacteriana. Inicialmente, implementou-se a metodologia em Mycobacterium smegmatis mc2155 (M. smegmatis) utilizando o gene inhA como alvo, que através de ensaios de determinação de concentração mínima inibitória (CMI) de anidrotetraciclina (ATc) e spot plating, demonstrou ser vulnerável à indução (CMI ≤ 0.78 µg/mL) e essencial ao crescimento e viabilidade bacteriana. Posteriormente, treze genes selecionados para M. tuberculosis - efp, ask, thiC, rpIR, infA, asd, ftsX, rpIN, aroF, fadD32, ino1, prpC e Rv2050 – que evidenciaram estar sob pressão seletiva purificante e restrição mutacional, foram utilizados como alvos de CRISPRi, que demonstrou a invulnerabilidade à inibição e não essencialidade dos genes prpC e Rv2050 no crescimento e viabilidade da micobactéria. Pelo contrário, validou-se preliminarmente os genes efp, ask, thiC, rpIR, infA, asd, ftsX, rpIN, aroF, fadD32 e ino1 como potenciais novos alvos terapêuticos no combate à TB, uma vez que demonstraram vulnerabilidade à inibição e essencialidade no crescimento e viabilidade bacteriana. |
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