Publicação

Helicobacter pylori prophages : distribution, diversity and contribution to bacterial fitness and pathogenicity

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa que coloniza cronicamente o estômago de metade da população mundial. A infeção leva à inflamação crónica, e em muitos casos permanece assintomática, mas, em cerca de 20% dos indivíduos infetados, pode levar ao desenvolvimento de várias doenças do trato digestivo, incluindo gastrite crónica, úlcera gástrica ou duodenal, linfoma do tecido associado à mucosa gástrica e cancro gástrico. A infeção por H. pylori difere a nível geográfico e estrato socioeconómico, e nos países em desenvolvimento apresenta uma taxa de 80% de infeção da população, enquanto em países desenvolvidos o número é muito inferior, com taxa de 40%. A prevalência desta bactéria aumenta quando as condições socioeconómicas são precárias, particularmente, as condições de vida em criança que é considerado um fator determinante importante na aquisição da infeção. Estima-se que a infeção ocorre a partir de uma transmissão vertical (pessoa-a-pessoa) via gastro-oral, oral-oral, fecal-oral ou ambos. Para além disso, outra possível forma de transmissão horizontal é através de alimentos contaminados, apesar de esta bactéria sobreviver por um período curto em comida refrigerada e sistemas de distribuição de água. A infeção por H. pylori pode ser erradicada com uma terapia de antibióticos, mas na última década a emergência de estirpes resistentes aumentou de forma drástica. A plasticidade do genoma bacteriano pode explicar o alto nível de adaptabilidade de H. pylori e o seu sucesso como agente patogénico humano. O processo de colonização é facilitado e induz inflamação através de vários fatores de virulência que estão associados com o risco de doenças gástricas severas, como adesinas, motilidade, urease, ilha de patogenicidade Cag e citotoxina vacuolizante. A grande diversidade genética de H. pylori, que é uma bactéria naturalmente competente, pode ser explicada pelo facto de ter uma alta frequência de mutação através do rearranjo do DNA e transferência horizontal de genes (HGT). Estes mecanismos de transferência horizontal são mediados por elementos móveis de DNA como plasmídeos, transposões e fagos, que são cruciais para a evolução bacteriana e plasticidade genómica. Esta bactéria consegue então adquirir genes de virulência e resistência a antibióticos, alterando a sua patogenicidade. Para além disto, a grande variabilidade genética entre estirpes está associada com a população ou a sua origem geográfica, pois a colonização crónica no estômago permitiu que H. pylori evoluísse estratégias de sobrevivência em paralelo com o seu hospedeiro natural, muito antes dos humanos saírem do continente africano. As migrações humanas ao longo do tempo resultaram numa diversidade biogeográfica desta bactéria formando as seguintes populações: hpAfrica1, hpAfrica2, hpNEAfrica, hpSahul, hpAsia2, hpEurope and hpEastAsia. Os bacteriófagos (fagos) são vírus que infetam exclusivamente bactérias e são considerados como o agente biológico mais abundante da Terra, mas estima-se que apenas 1% foi descrito ou identificado. Os fagos podem ser líticos, lisogénicos ou pseudolisogénicos. Num ciclo de replicação lítico, o fago invade o hospedeiro usa os recursos da célula para produzir o seu genoma e proteínas da cápside e provoca a lise libertando múltiplas cópias do vírus. No ciclo de replicação lisogénico, o bacteriófago integra-se no genoma da bactéria ou torna-se um elemento epissomal. Quando a bactéria se multiplica passa à sua progenia o genoma do fago. No entanto, em resposta a alterações ambientais este fago pode entrar num ciclo lítico e elimina o hospedeiro. No ciclo pseudolisogénico, o fago não entra numa via lítica nem se integra no genoma da bactéria o que acontece em hospedeiros com deficiência de nutrientes o que resulta num fago não integrado, semelhante a um epissoma e sobrevive durante um longo período. Uma vez que o status nutricional é restaurado o fago entra num ciclo lítico ou lisogénico. Os bacteriófagos são veículos importantes no processo de HGT entre várias espécies bacterianas e causam a transferência de diferentes genes envolvidos em comportamentos biológicos bacterianos. Com isto, o fago pode expressar genes que não são necessários para o seu ciclo de vida mas beneficiam o hospedeiro, que dependendo do valor de pressão seletiva podem levar à expansão clonal dos mesmos. H. pylori apresenta sequências de profago no seu genoma, que podem formar um profago completo, ou apenas remanescentes, e que estão presentes em cerca de 20% das estirpes, segundo a literatura. Esta diversidade genética adicional pode fornecer vantagens metabólicas ou mecanismos de tolerância que aumentem o fitness da bactéria e ajudar a colonizar diferentes populações humanas. Estas sequências do fago são diferentes entre si e são caracterizadas pela distribuição filogeográfica formando populações: hpAfrica1, hpEastAsia, hpNEurope and hpSWEurope. Existe uma semelhança filogeográfica entre genes do fago e da bactéria o que sugere uma coevolução entre o vírus e o seu hospedeiro. No entanto, ainda não se sabe se funções específicas dos fagos em H. pylori contribuem para o aumento de patogenicidade ou associação a estados específicos de doenças. O objetivo deste estudo foi avaliar a importância de profagos na evolução de H. pylori, como os profagos evoluem no genoma bacteriano e se a presença destes afeta o fitness e patogenicidade de H. pylori. Com isto avaliou-se a distribuição dos profagos em 256 isolados clínicos de H. pylori de diferentes pacientes portugueses e correlacionou-se com dados clínicos, demográficos, resistência aos antibióticos e genes de virulência. Observou-se que mais de metade da população em estudo era constituída por adultos (59.8%) e a maior parte (60.2%) era constituída por pacientes do sexo feminino. Relativamente à distribuição de resistência a antibióticos das estirpes de H. pylori, 65.6% apresentava pelo menos uma resistência a uma família de antibióticos e 16% da população apresentava resistência a mais do que uma família de antibióticos. As resistências mais comuns de antibióticos foram ao metronidazole (43%), eritromicina (43%) e ciprofloxacina (30%). A frequência de genes de profago em H. pylori foi de 38%, valor superior relativamente ao que já foi descrito, o que sugere que a presença de profagos no genoma de H. pylori é mais abrangente em relação ao que se assumia originalmente. Com uma percentagem de 91% para a presença do gene integrase e 9% para a presença dos genes integrase e holina, sugerindo a presença de remanescentes de fagos na maioria dos casos. Nestas estirpes avaliouse a presença do alelo s1 e s2 para o gene vacA e do gene cagA. Concluiu-se que a maioria das estirpes apresentava o alelo s2 (63%) e era cagA negativa (64%). A alta percentagem da presença de genes de profago pode indicar a importância da diversificação do genoma bacteriano e fitness e ter um papel importante em processos de adaptação contribuindo para a evolução da virulência. A correlação entre outras bactérias hospedeiras e a presença de profagos e virulência já foi descrita, mas neste caso não se encontrou correlação entre a presença de genes de profagos e: i) e a resistência da bactéria a antibióticos; ii) a presença do gene cagA e a forma alélica mais tóxica de vacA; iii), e fatores sociodemográficos como a distribuição etária, o género dos pacientes e o tratamento prévio para H. pylori. No entanto, não se pode excluir a possibilidade de existir uma possível correlação entre a existência de genes de profagos e outros factores de virulência não pesquisados no presente estudo, como já foi descrito em bactérias como por exemplo Escherichia coli e Bacillus subtilis. De seguida, fez-se uma análise do genoma dos profagos e uma reconstrução filogenética a partir do gene fágico da integrase deste grupo de estirpes; a árvore resultante revelou quatro clusters que correspondem às populações de prophage sequence typing (PST) que foram hpAfrica1, hpEastAsia, hpSWEurope e hpNEurope. Esta análise ilustrou e corroborou a conservação dos locais de inserção e a diversidade da estrutura populacional dos profagos de H. pylori e sugere um indicativo forte biogeográfico na diversidade genética do gene integrase. Estes resultados são consistentes com o modelo de coevolução entre vírus e hospedeiro. Para avaliar a performance de formação de biofilmes com a presença de profagos, construiu-se mutantes profago-knockout a partir da substituição do gene da integrase por uma cassete de resistência à canamicina. De cinco estirpes selecionadas, apenas uma estirpe (ALG001) foi transformada com sucesso. No estudo de formação de biofilmes observou-se que a estirpe wild-type ALG001 apresentava uma alta produção de biofilmes e a estirpe mutante ALG001 era produtora, embora fraca, de biofilmes, com uma diferença relevante a nível estatístico o que pode significar que a presença de profago pode influenciar a virulência de H. pylori. Para além disto, determinou-se a composição da matrix de biofilmes da estirpe ALG001 através de um tratamento com proteinase K e DNase I a diferentes concentrações e observou-se uma redução na produção de biofilme, tendo-se identificado que as proteínas são fundamentais na formação de biofilmes tanto na estirpe wild-type como na estirpe mutante. Portanto, para progredir neste tópico, será necessário realizar mais estudos no futuro para validar e clarificar as funções específicas dos profagos em H. pylori e o seu papel na virulência deste importante agente patogénico.
Autores principais:	Domingos, Carolina Marques
Assunto:	Helicobacter pylori Profagos Estrutura populacional Virulência Biofilmes Teses de mestrado - 2023
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso embargado
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa que coloniza cronicamente o estômago de metade da população mundial. A infeção leva à inflamação crónica, e em muitos casos permanece assintomática, mas, em cerca de 20% dos indivíduos infetados, pode levar ao desenvolvimento de várias doenças do trato digestivo, incluindo gastrite crónica, úlcera gástrica ou duodenal, linfoma do tecido associado à mucosa gástrica e cancro gástrico. A infeção por H. pylori difere a nível geográfico e estrato socioeconómico, e nos países em desenvolvimento apresenta uma taxa de 80% de infeção da população, enquanto em países desenvolvidos o número é muito inferior, com taxa de 40%. A prevalência desta bactéria aumenta quando as condições socioeconómicas são precárias, particularmente, as condições de vida em criança que é considerado um fator determinante importante na aquisição da infeção. Estima-se que a infeção ocorre a partir de uma transmissão vertical (pessoa-a-pessoa) via gastro-oral, oral-oral, fecal-oral ou ambos. Para além disso, outra possível forma de transmissão horizontal é através de alimentos contaminados, apesar de esta bactéria sobreviver por um período curto em comida refrigerada e sistemas de distribuição de água. A infeção por H. pylori pode ser erradicada com uma terapia de antibióticos, mas na última década a emergência de estirpes resistentes aumentou de forma drástica. A plasticidade do genoma bacteriano pode explicar o alto nível de adaptabilidade de H. pylori e o seu sucesso como agente patogénico humano. O processo de colonização é facilitado e induz inflamação através de vários fatores de virulência que estão associados com o risco de doenças gástricas severas, como adesinas, motilidade, urease, ilha de patogenicidade Cag e citotoxina vacuolizante. A grande diversidade genética de H. pylori, que é uma bactéria naturalmente competente, pode ser explicada pelo facto de ter uma alta frequência de mutação através do rearranjo do DNA e transferência horizontal de genes (HGT). Estes mecanismos de transferência horizontal são mediados por elementos móveis de DNA como plasmídeos, transposões e fagos, que são cruciais para a evolução bacteriana e plasticidade genómica. Esta bactéria consegue então adquirir genes de virulência e resistência a antibióticos, alterando a sua patogenicidade. Para além disto, a grande variabilidade genética entre estirpes está associada com a população ou a sua origem geográfica, pois a colonização crónica no estômago permitiu que H. pylori evoluísse estratégias de sobrevivência em paralelo com o seu hospedeiro natural, muito antes dos humanos saírem do continente africano. As migrações humanas ao longo do tempo resultaram numa diversidade biogeográfica desta bactéria formando as seguintes populações: hpAfrica1, hpAfrica2, hpNEAfrica, hpSahul, hpAsia2, hpEurope and hpEastAsia. Os bacteriófagos (fagos) são vírus que infetam exclusivamente bactérias e são considerados como o agente biológico mais abundante da Terra, mas estima-se que apenas 1% foi descrito ou identificado. Os fagos podem ser líticos, lisogénicos ou pseudolisogénicos. Num ciclo de replicação lítico, o fago invade o hospedeiro usa os recursos da célula para produzir o seu genoma e proteínas da cápside e provoca a lise libertando múltiplas cópias do vírus. No ciclo de replicação lisogénico, o bacteriófago integra-se no genoma da bactéria ou torna-se um elemento epissomal. Quando a bactéria se multiplica passa à sua progenia o genoma do fago. No entanto, em resposta a alterações ambientais este fago pode entrar num ciclo lítico e elimina o hospedeiro. No ciclo pseudolisogénico, o fago não entra numa via lítica nem se integra no genoma da bactéria o que acontece em hospedeiros com deficiência de nutrientes o que resulta num fago não integrado, semelhante a um epissoma e sobrevive durante um longo período. Uma vez que o status nutricional é restaurado o fago entra num ciclo lítico ou lisogénico. Os bacteriófagos são veículos importantes no processo de HGT entre várias espécies bacterianas e causam a transferência de diferentes genes envolvidos em comportamentos biológicos bacterianos. Com isto, o fago pode expressar genes que não são necessários para o seu ciclo de vida mas beneficiam o hospedeiro, que dependendo do valor de pressão seletiva podem levar à expansão clonal dos mesmos. H. pylori apresenta sequências de profago no seu genoma, que podem formar um profago completo, ou apenas remanescentes, e que estão presentes em cerca de 20% das estirpes, segundo a literatura. Esta diversidade genética adicional pode fornecer vantagens metabólicas ou mecanismos de tolerância que aumentem o fitness da bactéria e ajudar a colonizar diferentes populações humanas. Estas sequências do fago são diferentes entre si e são caracterizadas pela distribuição filogeográfica formando populações: hpAfrica1, hpEastAsia, hpNEurope and hpSWEurope. Existe uma semelhança filogeográfica entre genes do fago e da bactéria o que sugere uma coevolução entre o vírus e o seu hospedeiro. No entanto, ainda não se sabe se funções específicas dos fagos em H. pylori contribuem para o aumento de patogenicidade ou associação a estados específicos de doenças. O objetivo deste estudo foi avaliar a importância de profagos na evolução de H. pylori, como os profagos evoluem no genoma bacteriano e se a presença destes afeta o fitness e patogenicidade de H. pylori. Com isto avaliou-se a distribuição dos profagos em 256 isolados clínicos de H. pylori de diferentes pacientes portugueses e correlacionou-se com dados clínicos, demográficos, resistência aos antibióticos e genes de virulência. Observou-se que mais de metade da população em estudo era constituída por adultos (59.8%) e a maior parte (60.2%) era constituída por pacientes do sexo feminino. Relativamente à distribuição de resistência a antibióticos das estirpes de H. pylori, 65.6% apresentava pelo menos uma resistência a uma família de antibióticos e 16% da população apresentava resistência a mais do que uma família de antibióticos. As resistências mais comuns de antibióticos foram ao metronidazole (43%), eritromicina (43%) e ciprofloxacina (30%). A frequência de genes de profago em H. pylori foi de 38%, valor superior relativamente ao que já foi descrito, o que sugere que a presença de profagos no genoma de H. pylori é mais abrangente em relação ao que se assumia originalmente. Com uma percentagem de 91% para a presença do gene integrase e 9% para a presença dos genes integrase e holina, sugerindo a presença de remanescentes de fagos na maioria dos casos. Nestas estirpes avaliouse a presença do alelo s1 e s2 para o gene vacA e do gene cagA. Concluiu-se que a maioria das estirpes apresentava o alelo s2 (63%) e era cagA negativa (64%). A alta percentagem da presença de genes de profago pode indicar a importância da diversificação do genoma bacteriano e fitness e ter um papel importante em processos de adaptação contribuindo para a evolução da virulência. A correlação entre outras bactérias hospedeiras e a presença de profagos e virulência já foi descrita, mas neste caso não se encontrou correlação entre a presença de genes de profagos e: i) e a resistência da bactéria a antibióticos; ii) a presença do gene cagA e a forma alélica mais tóxica de vacA; iii), e fatores sociodemográficos como a distribuição etária, o género dos pacientes e o tratamento prévio para H. pylori. No entanto, não se pode excluir a possibilidade de existir uma possível correlação entre a existência de genes de profagos e outros factores de virulência não pesquisados no presente estudo, como já foi descrito em bactérias como por exemplo Escherichia coli e Bacillus subtilis. De seguida, fez-se uma análise do genoma dos profagos e uma reconstrução filogenética a partir do gene fágico da integrase deste grupo de estirpes; a árvore resultante revelou quatro clusters que correspondem às populações de prophage sequence typing (PST) que foram hpAfrica1, hpEastAsia, hpSWEurope e hpNEurope. Esta análise ilustrou e corroborou a conservação dos locais de inserção e a diversidade da estrutura populacional dos profagos de H. pylori e sugere um indicativo forte biogeográfico na diversidade genética do gene integrase. Estes resultados são consistentes com o modelo de coevolução entre vírus e hospedeiro. Para avaliar a performance de formação de biofilmes com a presença de profagos, construiu-se mutantes profago-knockout a partir da substituição do gene da integrase por uma cassete de resistência à canamicina. De cinco estirpes selecionadas, apenas uma estirpe (ALG001) foi transformada com sucesso. No estudo de formação de biofilmes observou-se que a estirpe wild-type ALG001 apresentava uma alta produção de biofilmes e a estirpe mutante ALG001 era produtora, embora fraca, de biofilmes, com uma diferença relevante a nível estatístico o que pode significar que a presença de profago pode influenciar a virulência de H. pylori. Para além disto, determinou-se a composição da matrix de biofilmes da estirpe ALG001 através de um tratamento com proteinase K e DNase I a diferentes concentrações e observou-se uma redução na produção de biofilme, tendo-se identificado que as proteínas são fundamentais na formação de biofilmes tanto na estirpe wild-type como na estirpe mutante. Portanto, para progredir neste tópico, será necessário realizar mais estudos no futuro para validar e clarificar as funções específicas dos profagos em H. pylori e o seu papel na virulência deste importante agente patogénico.