Publicação

Using micropatterning of hiPSCs to induce PGC formation

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O estudo in vitro do desenvolvimento dos gâmetas é essencial para compreender os aspetos determinantes da fertilidade em mamíferos e em particular em humanos. Nesse âmbito inclui-se nesta tese a investigação das células precursoras deste tipo celular, as Células Germinais Primordiais (PGCs). De acordo com estudos anteriores em ratinho, as células precursoras das PGCs (pPGCs) podem ser identificadas durante o período de gastrulação. Restrições éticas e legislativas relativas à utilização de embriões humanos em fase de gastrulação se insere impedem o estudo destas últimas com recurso a cultura de embriões humanos. Como estas restrições excluem a possibilidade de efetuar análises no período em que se estima abranger a gastrulação humana, não é possível atualmente estudar estes acontecimentos com base em observações feitas com embriões humanos. Por este motivo recorreu-se a um método de cultura celular usando diferenciação de células humanas pluripotentes induzidas (hiPSCs) e células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Este método permite replicar até um certo ponto a gastrulação in vivo. O método 2D de cultura de células desenvolvido por Warmflash et al. (2014) foi escolhido como base. Este método apoia-se na micropadronização de lamelas (com fibronectina) para obter diferenciação celular, com estimulação da via da proteína morfogenética do osso (bone morphogenetic protein4, BMP4). Tentou-se reproduzir o aparecimento dos folhetos germinativos e a sua organização em domínios distintos mutuamente repressivos, devido a moléculas secretadas por cada folheto germinativo que asseguram que células características de um não se formem nos restantes folhetos. O método de Warmflash et al. (2014) recapitula, deste modo, a gastrulação in vitro. No entanto, tal organização foi impossível de obter devido a cobertura sub-ótima dos micropadrões. Este grau de cobertura terá resultado de incompatibilidades entre células e a proteína constituinte dos micropadrões, a fibronectina (FN1). Por este motivo, um outro método baseado na cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em lamelas revestidas com matrigel foi usado, também almejando a geração de PGCs in vitro. Este método produziu resultados positivos, visto que células positivas para três marcadores-chave de PGCs foram detetadas. Estas células foram detetadas ao aplicar imunofluorescência (usando um painel de anticorpos) refinado por meio de análise bioinformática, a partir de marcadores extraídos da literatura. Estes marcadores permitiram evidenciar, por meio de imagiologia às lamelas, a presença de potenciais PGCs. Com este método foi possível induzir potenciais PGCs, abrindo-se um novo meio para investigar os mecanismos e vias de sinalização para estudar estas células sem ter de recorrer ao uso de animais ou embriões humanos em cultura.
Autores principais:	Bretes, Francisco Vieira
Assunto:	PGC Micropadronização hiPSC Gastrulação in vitro hESCs Teses de mestrado - 2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O estudo in vitro do desenvolvimento dos gâmetas é essencial para compreender os aspetos determinantes da fertilidade em mamíferos e em particular em humanos. Nesse âmbito inclui-se nesta tese a investigação das células precursoras deste tipo celular, as Células Germinais Primordiais (PGCs). De acordo com estudos anteriores em ratinho, as células precursoras das PGCs (pPGCs) podem ser identificadas durante o período de gastrulação. Restrições éticas e legislativas relativas à utilização de embriões humanos em fase de gastrulação se insere impedem o estudo destas últimas com recurso a cultura de embriões humanos. Como estas restrições excluem a possibilidade de efetuar análises no período em que se estima abranger a gastrulação humana, não é possível atualmente estudar estes acontecimentos com base em observações feitas com embriões humanos. Por este motivo recorreu-se a um método de cultura celular usando diferenciação de células humanas pluripotentes induzidas (hiPSCs) e células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Este método permite replicar até um certo ponto a gastrulação in vivo. O método 2D de cultura de células desenvolvido por Warmflash et al. (2014) foi escolhido como base. Este método apoia-se na micropadronização de lamelas (com fibronectina) para obter diferenciação celular, com estimulação da via da proteína morfogenética do osso (bone morphogenetic protein4, BMP4). Tentou-se reproduzir o aparecimento dos folhetos germinativos e a sua organização em domínios distintos mutuamente repressivos, devido a moléculas secretadas por cada folheto germinativo que asseguram que células características de um não se formem nos restantes folhetos. O método de Warmflash et al. (2014) recapitula, deste modo, a gastrulação in vitro. No entanto, tal organização foi impossível de obter devido a cobertura sub-ótima dos micropadrões. Este grau de cobertura terá resultado de incompatibilidades entre células e a proteína constituinte dos micropadrões, a fibronectina (FN1). Por este motivo, um outro método baseado na cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em lamelas revestidas com matrigel foi usado, também almejando a geração de PGCs in vitro. Este método produziu resultados positivos, visto que células positivas para três marcadores-chave de PGCs foram detetadas. Estas células foram detetadas ao aplicar imunofluorescência (usando um painel de anticorpos) refinado por meio de análise bioinformática, a partir de marcadores extraídos da literatura. Estes marcadores permitiram evidenciar, por meio de imagiologia às lamelas, a presença de potenciais PGCs. Com este método foi possível induzir potenciais PGCs, abrindo-se um novo meio para investigar os mecanismos e vias de sinalização para estudar estas células sem ter de recorrer ao uso de animais ou embriões humanos em cultura.