Publicação

NLRP3 inflammasome-driven neurodegeneration and epileptiform activity in a model of epileptogenesis in organotypic slices

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A epilepsia é uma doença neurológica que afeta mundialmente cerca de 65 milhões de pessoas, tornando-a uma das mais comuns em todo o mundo. Esta doença é caracterizada pela predisposição para gerar convulsões periódicas e imprevisíveis, isto é, episódios de atividade neuronal sincronizada e excessiva. Apesar da existência de fármacos antiepiléticos, um terço dos pacientes continuam a sofrer progressão da doença e declínio cognitivo, tornando imperativo o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, tentando assim prevenir ou atrasar as consequências da epilepsia. Vários estudos demonstram que a epilepsia está fortemente associada à neuro inflamação. A epilepsia do lobo temporal, uma das formas mais comuns e severas de epilepsia, ataca maioritariamente o hipocampo e está relacionada com eventos inflamatórios que culminam em morte neuronal e aumento de expressão de fatores inflamatórios. Um dos principais fatores é a interleucina-1β (IL-1β), que promove disfunção sináptica, hiperexcitabilidade e morte neuronal. Em circunstâncias fisiológicas, a neuroinflamação tem efeitos benéficos, atuando como proteção contra infeções e reparação de danos, mas quando a sua duração e intensidade excedem o limite homeostático, pode tornar-se crónica e ter efeitos severos como a indução de doenças do foro neurológico, tais como a Doença de Alzheimer ou a epilepsia. Visto isto, a neuro inflamação é considerada como um potencial alvo terapêutico para o combate à epilepsia. Recentemente, o inflamassoma NLRP3 tem sido frequentemente associado ao processo de epileptogénese. Este complexo multiproteico citoplasmático é constituído por 3 componentes, um sensor (NLRP3), um adaptador (ASC) e um efetor (Caspase-1), sendo responsável pela maturação da IL-1β por ativação da Caspase-1 e é considerado um fator-chave para a propagação e regulação da neuroinflamação. Este inflamassoma tem sido associado à morte celular por piroptose, um processo mediado pela Gasdermin D (GSDMD) quando clivada pela Caspase-1, no contexto de várias doenças neurológicas. A morte neuronal é uma das principais características da epilepsia, mas a relevância da morte neuronal por piroptose não está ainda esclarecida nesta patologia. Estudos demonstram que a inibição do NLRP3, tem um efeito neuroprotetor num modelo animal de epilepsia. Resultados preliminares obtidos no grupo, indicam que o MCC950, um inibidor seletivo deste complexo multiproteico, é capaz de diminuir a atividade epileptiforme de fatias organotípicas. Este estudo pretende avaliar a progressão da atividade epileptiforme e a ocorrência de morte neuronal por piroptose num modelo de epileptogénese ex vivo, assim como explorar a influência do inflamassoma NLRP3 na geração destes eventos. Foi utilizado um modelo de epileptogénese em fatias organotípicas de córtex rinal e hipocampo preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley com 6-7 dias de vida (P6-7). Este modelo é uma ferramenta simples e útil no estudo da epileptogénese, já que replica características do ambiente in vivo do hipocampo como a conectividade neuronal e a plasticidade sináptica, permitindo assim, a geração de atividade epileptiforme. Além disso, as fatias organotípicas podem ser mantidas por longos períodos de tempo, o que permite a sua manipulação e estudos a longo prazo. Para os ensaios realizados foram recolhidas amostras aos dias 3, 7, 14, e 21 in vitro (DIV), permitindo assim o estudo da evolução, não só da atividade epileptiforme, bem como da morte neuronal e presença do inflamassoma em neurónios. A atividade epileptiforme foi avaliada através de registos eletrofisiológicos, obtidos numa câmara de interface. A atividade foi captada por registos eletrofisiológicos na região da cornus ammonis 3 (CA3), já que é a mais frequentemente afetada por bursts de atividade ictal. Este tipo de atividade é caracterizada por surtos contínuos de eventos epiléticos que duram mais de 10s e distinguidos entre si quando o intervalo que os separa é maior que 2s. O efeito do MCC950 na atividade epileptiforme também foi avaliado através de registos eletrofisiológicos. A morte celular foi avaliada pela incorporação celular de iodeto de propídio (PI). Este composto fluorescente incorpora-se entre os ácidos nucleicos de células com membrana permeabilizada, permitindo assim distinguir células em processo de morte celular. Também o progresso da expressão da proteína efectora da piroptose (GSDMD) e dos componentes do inflamassoma NLRP3, foram avaliados por western blot, e por ensaios de imunohistoquímica paralelamente a um marcador nuclear de neurónios (NeuN). A produção de espécies reativas de oxigénio (ROS), potenciais ativadores do inflamassoma no sistema em estudo, foi avaliada usando um composto que após ser clivado por ROS, gera um produto fluorescente que pode ser detetado por microscopia de fluorescência. A atividade epileptiforme foi caracterizada pelos seguintes parâmetros: número e duração de bursts, número de eventos por burst, amplitude e frequência. A maioria dos parâmetros atinge o máximo em fatias com 13-15 DIV, onde a atividade epileptiforme é maioritariamente ictal. Os valores de IL-1β libertada estão de acordo com o clímax de atividade detetada, já que aumentam progressivamente até atingirem o máximo ao 17 DIV. O ensaio de morte celular revelou desigualdades entre as zonas do hipocampo, sendo os neurónios granulares do giro denteado (DG) e os neurónios piramidais da CA1 mais afetados que os neurónios da CA3, o que vai de acordo com a literatura. Em relação à progressão da morte celular, além da CA3 que demonstra decréscimo significativo de 7 a 21 DIV, as restantes regiões não apresentam alterações consideráveis, provavelmente devido ao baixo número de fatias avaliadas. É de notar que todas as zonas mostraram elevada incidência de morte neuronal ao 3 DIV, o que pode ser explicado pelo stress causado pelo corte das fatias. A clivagem de GSDMD no hipocampo mostra máximos ao 7 DIV reduzindo até ao final da cultura. Para além disso, ocorre co-localização de GSDMD com neurónios, confirmando morte neuronal por piroptose no modelo de epileptogénese em estudo. Resultados anteriores referentes à αII-Espetrina, que quando clivada por protéases associadas a processos de morte neuronal, nomeadamente calpaínas, origina produtos intervenientes no processo de morte por necrose, indicam morte neuronal por necrose a tempos mais tardios de cultura. Estes resultados sugerem prevalência de morte neuronal por piroptose até ao 7 DIV, mas ao longo do tempo em cultura, a necrose passa a ser a forma principal de morte neuronal. A expressão dos componentes do inflamassoma foi avaliada neste sistema ao longo do tempo de cultura. A diminuição do domínio NLRP3 é explicada pela ausência de estímulos de priming no sistema, não sendo portanto estimulada a sua expressão. Quanto ao ASC e à Caspase-1, não são verificadas diferenças significativas, mas a expressão da Caspase-1 demonstra uma tendência para aumento de 3 para 7 DIV, sugerindo ativação do inflamassoma. Os ensaios de imunohistoquímica detetaram componentes do inflamassoma, nomeadamente o NLRP3 e o ASC, em neurónios, o que contribui com mais provas de que o complexo está presente em neurónios, facto ainda pouco descrito pela comunidade científica. Apesar da expressão do inflamassoma diminuir ao longo do tempo de cultura, os resultados sugerem a sua ativação por ROS, já que os valores de ROS aumentam com o tempo em cultura, especialmente em DG e CA1, onde efetivamente ocorre prevalência de morte neuronal. A ação inibitória do MCC950 sobre o NLRP3 teve um impacto evidente na atividade epileptiforme. A sua presença durante os registos electrofisiológicos quase anulou a atividade ictal, com uma diminuição significativa em praticamente todos os parâmetros avaliados. Isto demonstra que o NLRP3 está diretamente envolvido na geração da atividade epileptiforme no sistema em estudo. Em suma, este trabalho demonstrou ocorrência de morte neuronal por piroptose mediada pelo inflamassoma NLRP3. Igualmente provou que a inibição deste complexo consegue reduzir significativamente a geração de atividade epileptiforme espontânea, podendo assim ser um potential alvo terapêutico para a epilepsia.
Autores principais:	Meda, Francisco José Gonçalves
Assunto:	Epilepsia Atividade epileptiforme Inflamassoma NLRP3 Piroptose MCC950 Teses de mestrado - 2021
Ano:	2021
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A epilepsia é uma doença neurológica que afeta mundialmente cerca de 65 milhões de pessoas, tornando-a uma das mais comuns em todo o mundo. Esta doença é caracterizada pela predisposição para gerar convulsões periódicas e imprevisíveis, isto é, episódios de atividade neuronal sincronizada e excessiva. Apesar da existência de fármacos antiepiléticos, um terço dos pacientes continuam a sofrer progressão da doença e declínio cognitivo, tornando imperativo o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, tentando assim prevenir ou atrasar as consequências da epilepsia. Vários estudos demonstram que a epilepsia está fortemente associada à neuro inflamação. A epilepsia do lobo temporal, uma das formas mais comuns e severas de epilepsia, ataca maioritariamente o hipocampo e está relacionada com eventos inflamatórios que culminam em morte neuronal e aumento de expressão de fatores inflamatórios. Um dos principais fatores é a interleucina-1β (IL-1β), que promove disfunção sináptica, hiperexcitabilidade e morte neuronal. Em circunstâncias fisiológicas, a neuroinflamação tem efeitos benéficos, atuando como proteção contra infeções e reparação de danos, mas quando a sua duração e intensidade excedem o limite homeostático, pode tornar-se crónica e ter efeitos severos como a indução de doenças do foro neurológico, tais como a Doença de Alzheimer ou a epilepsia. Visto isto, a neuro inflamação é considerada como um potencial alvo terapêutico para o combate à epilepsia. Recentemente, o inflamassoma NLRP3 tem sido frequentemente associado ao processo de epileptogénese. Este complexo multiproteico citoplasmático é constituído por 3 componentes, um sensor (NLRP3), um adaptador (ASC) e um efetor (Caspase-1), sendo responsável pela maturação da IL-1β por ativação da Caspase-1 e é considerado um fator-chave para a propagação e regulação da neuroinflamação. Este inflamassoma tem sido associado à morte celular por piroptose, um processo mediado pela Gasdermin D (GSDMD) quando clivada pela Caspase-1, no contexto de várias doenças neurológicas. A morte neuronal é uma das principais características da epilepsia, mas a relevância da morte neuronal por piroptose não está ainda esclarecida nesta patologia. Estudos demonstram que a inibição do NLRP3, tem um efeito neuroprotetor num modelo animal de epilepsia. Resultados preliminares obtidos no grupo, indicam que o MCC950, um inibidor seletivo deste complexo multiproteico, é capaz de diminuir a atividade epileptiforme de fatias organotípicas. Este estudo pretende avaliar a progressão da atividade epileptiforme e a ocorrência de morte neuronal por piroptose num modelo de epileptogénese ex vivo, assim como explorar a influência do inflamassoma NLRP3 na geração destes eventos. Foi utilizado um modelo de epileptogénese em fatias organotípicas de córtex rinal e hipocampo preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley com 6-7 dias de vida (P6-7). Este modelo é uma ferramenta simples e útil no estudo da epileptogénese, já que replica características do ambiente in vivo do hipocampo como a conectividade neuronal e a plasticidade sináptica, permitindo assim, a geração de atividade epileptiforme. Além disso, as fatias organotípicas podem ser mantidas por longos períodos de tempo, o que permite a sua manipulação e estudos a longo prazo. Para os ensaios realizados foram recolhidas amostras aos dias 3, 7, 14, e 21 in vitro (DIV), permitindo assim o estudo da evolução, não só da atividade epileptiforme, bem como da morte neuronal e presença do inflamassoma em neurónios. A atividade epileptiforme foi avaliada através de registos eletrofisiológicos, obtidos numa câmara de interface. A atividade foi captada por registos eletrofisiológicos na região da cornus ammonis 3 (CA3), já que é a mais frequentemente afetada por bursts de atividade ictal. Este tipo de atividade é caracterizada por surtos contínuos de eventos epiléticos que duram mais de 10s e distinguidos entre si quando o intervalo que os separa é maior que 2s. O efeito do MCC950 na atividade epileptiforme também foi avaliado através de registos eletrofisiológicos. A morte celular foi avaliada pela incorporação celular de iodeto de propídio (PI). Este composto fluorescente incorpora-se entre os ácidos nucleicos de células com membrana permeabilizada, permitindo assim distinguir células em processo de morte celular. Também o progresso da expressão da proteína efectora da piroptose (GSDMD) e dos componentes do inflamassoma NLRP3, foram avaliados por western blot, e por ensaios de imunohistoquímica paralelamente a um marcador nuclear de neurónios (NeuN). A produção de espécies reativas de oxigénio (ROS), potenciais ativadores do inflamassoma no sistema em estudo, foi avaliada usando um composto que após ser clivado por ROS, gera um produto fluorescente que pode ser detetado por microscopia de fluorescência. A atividade epileptiforme foi caracterizada pelos seguintes parâmetros: número e duração de bursts, número de eventos por burst, amplitude e frequência. A maioria dos parâmetros atinge o máximo em fatias com 13-15 DIV, onde a atividade epileptiforme é maioritariamente ictal. Os valores de IL-1β libertada estão de acordo com o clímax de atividade detetada, já que aumentam progressivamente até atingirem o máximo ao 17 DIV. O ensaio de morte celular revelou desigualdades entre as zonas do hipocampo, sendo os neurónios granulares do giro denteado (DG) e os neurónios piramidais da CA1 mais afetados que os neurónios da CA3, o que vai de acordo com a literatura. Em relação à progressão da morte celular, além da CA3 que demonstra decréscimo significativo de 7 a 21 DIV, as restantes regiões não apresentam alterações consideráveis, provavelmente devido ao baixo número de fatias avaliadas. É de notar que todas as zonas mostraram elevada incidência de morte neuronal ao 3 DIV, o que pode ser explicado pelo stress causado pelo corte das fatias. A clivagem de GSDMD no hipocampo mostra máximos ao 7 DIV reduzindo até ao final da cultura. Para além disso, ocorre co-localização de GSDMD com neurónios, confirmando morte neuronal por piroptose no modelo de epileptogénese em estudo. Resultados anteriores referentes à αII-Espetrina, que quando clivada por protéases associadas a processos de morte neuronal, nomeadamente calpaínas, origina produtos intervenientes no processo de morte por necrose, indicam morte neuronal por necrose a tempos mais tardios de cultura. Estes resultados sugerem prevalência de morte neuronal por piroptose até ao 7 DIV, mas ao longo do tempo em cultura, a necrose passa a ser a forma principal de morte neuronal. A expressão dos componentes do inflamassoma foi avaliada neste sistema ao longo do tempo de cultura. A diminuição do domínio NLRP3 é explicada pela ausência de estímulos de priming no sistema, não sendo portanto estimulada a sua expressão. Quanto ao ASC e à Caspase-1, não são verificadas diferenças significativas, mas a expressão da Caspase-1 demonstra uma tendência para aumento de 3 para 7 DIV, sugerindo ativação do inflamassoma. Os ensaios de imunohistoquímica detetaram componentes do inflamassoma, nomeadamente o NLRP3 e o ASC, em neurónios, o que contribui com mais provas de que o complexo está presente em neurónios, facto ainda pouco descrito pela comunidade científica. Apesar da expressão do inflamassoma diminuir ao longo do tempo de cultura, os resultados sugerem a sua ativação por ROS, já que os valores de ROS aumentam com o tempo em cultura, especialmente em DG e CA1, onde efetivamente ocorre prevalência de morte neuronal. A ação inibitória do MCC950 sobre o NLRP3 teve um impacto evidente na atividade epileptiforme. A sua presença durante os registos electrofisiológicos quase anulou a atividade ictal, com uma diminuição significativa em praticamente todos os parâmetros avaliados. Isto demonstra que o NLRP3 está diretamente envolvido na geração da atividade epileptiforme no sistema em estudo. Em suma, este trabalho demonstrou ocorrência de morte neuronal por piroptose mediada pelo inflamassoma NLRP3. Igualmente provou que a inibição deste complexo consegue reduzir significativamente a geração de atividade epileptiforme espontânea, podendo assim ser um potential alvo terapêutico para a epilepsia.