Publicação

Computational and validation approaches in proteomics discovery of disease biomarkers

Detalhes bibliográficos
Resumo:	O estudo em larga escala de proteínas, a proteómica, está a mudar amplamente a nossa compreensão das funções dos genes na era pós-genómica. Depois da revolução na genómica pelos métodos de sequenciação de ADN (ácido desoxirribonucleico), a proteómica tem vindo a aumentar o nosso conhecimento sobre a variabilidade, localização, função e vias metabólicas das proteínas na célula, tecido ou organismo. O desenvolvimento de biomarcadores, como uma componente relevante na tomada de decisões, tanto nos processos clínicos quanto no desenvolvimento de novos medicamentos, é uma área emergente onde a proteómica tem vindo a ganhar relevo. As tecnologias proteómicas permitem uma análise comparativa, qualitativa e quantitativa de milhares de proteínas de células/tecidos de doentes versus indivíduos controles, assim como, de doentes antes e depois de um determinado tratamento. As proteínas identificadas diferencialmente abundantes e/ou modificadas pós-traducionalmente na condição de doença ou em resposta a terapia, são possíveis candidatas a biomacardores destas condições. No entanto, a interpretação da enorme quantidade de dados proteómicos, gerados principalmente por experiências baseadas em espectrometria de massa (MS), requer suporte computacional para processamento e análise dos dados de forma efetiva e robusta. A Proteómica computacional estuda os métodos computacionais, algoritmos, bases de dados e metodologias utilizadas para processar, gerir, analisar e interpretar os dados produzidos em experiências proteómicas na identificação de potenciais biomarcadores. O Laboratório de Proteómica do INSA (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge), através da busca de biomarcadores proteómicos para compreensão de doenças tais como a Anemia das Células Falciformes (ACF), tem produzido grandes dados de MS que necessitam de análise computacional, sendo este o principal propósito deste projeto (ver abaixo objetivo deste estudo). A ACF, também denominada por drepanocitose ou anemia drepanocítica, é um distúrbio monogénico autossómico recessivo, clinicamente heterogéneo, caracterizado por episódios recorrentes de hemólise grave, vaso-oclusão e infecção. Vários modificadores genéticos e ambientais foram sugeridos para modular o início e o curso da ACF. Especificamente, os componentes vasculares da patologia (por exemplo, acidente vascular cerebral) foram submetidos a pesquisas intensivas e o uso de metodologias proteómicas promete oferecer novas percepções moleculares sobre a fisiopatologia da ACF. A mudança do estado estacionário para a crise ainda é em grande parte imprevisível. A fim de descobrir biomarcadores putativos para essa exacerbação, o laboratório do INSA analisou por proteómica de shotgun MS, amostras de plasma e glóbulos vermelhos (GV), de um grupo de pacientes com ACF em estado estacionário e em crise (episódio de vaso-oclusão). Objetivo do estudo: Este estudo teve como objetivo analisar os dados de shotgun MS gerados para a ACF através de plataformas de proteómica computacional de código aberto, nomeadamente o PatternLab e o MaxQuant , no sentido de identificar proteínas como possíveis candidatos a biomarcadores da ACF e em particular da ACF associada a vaso-oclusão. O PatternLab for Proteomics é um ambiente computacional integrado para análise de proteómica shotgun, formatando bancos de dados de sequências, que realizam a correspondência de espectro peptídico, filtrando estatisticamente e organizando dados por proteómica diferencial, exibindo resultados em formato de gráficos, realizando estudos orientados por similaridade com dados de sequenciação de novo, ajudando à compreensão do significado biológico dos dados à luz da Ontologia Genética (Gene Ontology). O MaxQuant é um conjunto de algoritmos, que inclui a detecção de picos e a pontuação de péptidos, realiza a calibração em massa e pesquisas em bancos de dados para identificação de proteínas, quantifica proteínas identificadas e fornece estatísticas resumidas. Para validar os achados proteómicos, algumas das proteínas identificadas diferencialmente na patologia por essas plataformas computacionais, foram selecionadas para validação (verificação) através de abordagens como Western blot. O Western blot é uma técnica bioquímica imunológica na qual uma mistura de proteínas é separada por gel 1DSDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), transferida para uma membrana, posteriormente incubada com anticorpo específico contra a proteína de interesse. A reação, geralmente visualizada por quimioluminescência, pode ser quantificada por densitometria. De todas as 111 proteínas diferencialmente expressas identificadas (74 da fração citoplasmática e 37 da fração membranar) associadas ao evento de crise na ACF, a peroxiredoxina-2, a catalase, a Hsp70 e Hsp 90 foram validadas por Western blot. Destas 4 proteínas, apenas a peroxiredoxina-2 apresentou significância estatística. Das proteínas diferencialmente expressas que hipoteticamente podem estar associadas à ACF, um promissor biomarcador de crise, nomeadamente, a Voltagedependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1) foi encontrada diminuída. Os resultados sugerem que episódios de vaso-oclusão em doentes com ACF podem estar associados à diminuição da VDAC1 nos glóbulos vermelhos. Os resultados deste projeto após apresentação e discussão podem contribuir para um melhor entendimento das vias moleculares associadas à ACF, bem como para a identificação de modulações proteicas específicas, como possíveis candidatos a biomarcadores para essas patologias.
Autores principais:	Costa, André Abrantes da
Assunto:	Proteómica Bioinformática Anemia das Células Falciformes Biomarcadores Western blot Teses de mestrado - 2019
Ano:	2019
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	O estudo em larga escala de proteínas, a proteómica, está a mudar amplamente a nossa compreensão das funções dos genes na era pós-genómica. Depois da revolução na genómica pelos métodos de sequenciação de ADN (ácido desoxirribonucleico), a proteómica tem vindo a aumentar o nosso conhecimento sobre a variabilidade, localização, função e vias metabólicas das proteínas na célula, tecido ou organismo. O desenvolvimento de biomarcadores, como uma componente relevante na tomada de decisões, tanto nos processos clínicos quanto no desenvolvimento de novos medicamentos, é uma área emergente onde a proteómica tem vindo a ganhar relevo. As tecnologias proteómicas permitem uma análise comparativa, qualitativa e quantitativa de milhares de proteínas de células/tecidos de doentes versus indivíduos controles, assim como, de doentes antes e depois de um determinado tratamento. As proteínas identificadas diferencialmente abundantes e/ou modificadas pós-traducionalmente na condição de doença ou em resposta a terapia, são possíveis candidatas a biomacardores destas condições. No entanto, a interpretação da enorme quantidade de dados proteómicos, gerados principalmente por experiências baseadas em espectrometria de massa (MS), requer suporte computacional para processamento e análise dos dados de forma efetiva e robusta. A Proteómica computacional estuda os métodos computacionais, algoritmos, bases de dados e metodologias utilizadas para processar, gerir, analisar e interpretar os dados produzidos em experiências proteómicas na identificação de potenciais biomarcadores. O Laboratório de Proteómica do INSA (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge), através da busca de biomarcadores proteómicos para compreensão de doenças tais como a Anemia das Células Falciformes (ACF), tem produzido grandes dados de MS que necessitam de análise computacional, sendo este o principal propósito deste projeto (ver abaixo objetivo deste estudo). A ACF, também denominada por drepanocitose ou anemia drepanocítica, é um distúrbio monogénico autossómico recessivo, clinicamente heterogéneo, caracterizado por episódios recorrentes de hemólise grave, vaso-oclusão e infecção. Vários modificadores genéticos e ambientais foram sugeridos para modular o início e o curso da ACF. Especificamente, os componentes vasculares da patologia (por exemplo, acidente vascular cerebral) foram submetidos a pesquisas intensivas e o uso de metodologias proteómicas promete oferecer novas percepções moleculares sobre a fisiopatologia da ACF. A mudança do estado estacionário para a crise ainda é em grande parte imprevisível. A fim de descobrir biomarcadores putativos para essa exacerbação, o laboratório do INSA analisou por proteómica de shotgun MS, amostras de plasma e glóbulos vermelhos (GV), de um grupo de pacientes com ACF em estado estacionário e em crise (episódio de vaso-oclusão). Objetivo do estudo: Este estudo teve como objetivo analisar os dados de shotgun MS gerados para a ACF através de plataformas de proteómica computacional de código aberto, nomeadamente o PatternLab e o MaxQuant , no sentido de identificar proteínas como possíveis candidatos a biomarcadores da ACF e em particular da ACF associada a vaso-oclusão. O PatternLab for Proteomics é um ambiente computacional integrado para análise de proteómica shotgun, formatando bancos de dados de sequências, que realizam a correspondência de espectro peptídico, filtrando estatisticamente e organizando dados por proteómica diferencial, exibindo resultados em formato de gráficos, realizando estudos orientados por similaridade com dados de sequenciação de novo, ajudando à compreensão do significado biológico dos dados à luz da Ontologia Genética (Gene Ontology). O MaxQuant é um conjunto de algoritmos, que inclui a detecção de picos e a pontuação de péptidos, realiza a calibração em massa e pesquisas em bancos de dados para identificação de proteínas, quantifica proteínas identificadas e fornece estatísticas resumidas. Para validar os achados proteómicos, algumas das proteínas identificadas diferencialmente na patologia por essas plataformas computacionais, foram selecionadas para validação (verificação) através de abordagens como Western blot. O Western blot é uma técnica bioquímica imunológica na qual uma mistura de proteínas é separada por gel 1DSDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), transferida para uma membrana, posteriormente incubada com anticorpo específico contra a proteína de interesse. A reação, geralmente visualizada por quimioluminescência, pode ser quantificada por densitometria. De todas as 111 proteínas diferencialmente expressas identificadas (74 da fração citoplasmática e 37 da fração membranar) associadas ao evento de crise na ACF, a peroxiredoxina-2, a catalase, a Hsp70 e Hsp 90 foram validadas por Western blot. Destas 4 proteínas, apenas a peroxiredoxina-2 apresentou significância estatística. Das proteínas diferencialmente expressas que hipoteticamente podem estar associadas à ACF, um promissor biomarcador de crise, nomeadamente, a Voltagedependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1) foi encontrada diminuída. Os resultados sugerem que episódios de vaso-oclusão em doentes com ACF podem estar associados à diminuição da VDAC1 nos glóbulos vermelhos. Os resultados deste projeto após apresentação e discussão podem contribuir para um melhor entendimento das vias moleculares associadas à ACF, bem como para a identificação de modulações proteicas específicas, como possíveis candidatos a biomarcadores para essas patologias.