Publication

Avaliação do potencial de patogenicidade de bactérias ácido-lácticas isoladas de queijos tradicionais portugueses

Bibliographic Details
Summary:	Os queijos de Nisa e Azeitão fazem parte da lista dos queijos portugueses com Denominação de Origem Protegida (DOP). Apesar de serem produzidos em regiões distintas, apresentam algumas semelhanças, tais como a utilização de leite de ovelha cru e o tipo de coalho (Cynara cardunculus). A produção destes queijos conta com a ação de bactérias ácido láticas que estão presentes no processo de fermentação e de maturação, tendo estas contribuições relevantes para as propriedades organoléticas do produto final. Estas bactérias, apesar de apresentarem inúmeras vantagens tecnológicas, podem ser veículos de transmissão de genes, tanto de resistência a antibióticos, como de fatores de virulência. Nesse contexto, esta dissertação teve como objetivo a caracterização microbiana de bactérias ácido láticas, particularmente Enterococcus spp., e a avaliação do seu potencial de patogenicidade. Por fim, a comparação entre os resultados obtidos no presente estudo e os obtidos ao longo dos anos 2016- 18. Durante o ano de 2019 foram recolhidos queijos produzidos em queijarias tradicionais de Azeitão e Nisa. A partir dessas amostras foram isoladas as bactérias ácido láticas, recorrendo a diferentes meios de cultura. De seguida, para a avaliação da diversidade microbiana dos isolados, foi aplicada a técnica de RAPD-PCR. A análise dos perfis obtidos permitiu a construção de dendrogramas e a partir destes foi possível avaliar a semelhança genómica entre os isolados, e consequentemente fazer a escolha dos representantes e calcular índices de diversidade. Os resultados obtidos para os queijos em análise, mostraram que os Lactococcus spp. são o grupo predominante, estando Enterococcus spp. presente em número mais reduzido, apesar da sua elevada diversidade genómica (demonstrada pelo cálculo dos índices de diversidade). Estes resultados foram concordantes com os obtidos em anos transatos. Uma análise mais detalhada dos enterococos, mostrou ser a espécie E. faecalis a predominante nos queijos DOP em estudo, seguida das espécies E. faecium e E. durans. Quanto à resistência a antibióticos, a mesma foi estudada com recurso a técnicas de difusão em disco e PCR-multiplex dirigido a determinantes de resistência. Foram observadas algumas diferenças no número de isolados resistentes ao longo dos anos de estudo. Enterococcus sp. mostraram ser resistentes à grande maioria dos antibióticos estudados e foi ainda identificado um isolado multirresistente. Em relação aos genes de resistência pesquisados, concluímos que 100% dos isolados resistentes à tetraciclina apresentam o gene tet(M), 67% dos isolados resistentes à eritromicina apresentam o gene erm(B) e, por fim, o isolado resistente à vancomicina não apresenta os genes van(A) ou van(B). Relativamente à pesquisa de fatores de virulência, verificou-se que 26% dos isolados apresentavam atividade positiva para a hemólise, uma percentagem bastante superior às obtidas em anos anteriores, 45% dos enterecocos demonstraram resultados positivos para a produção de gelatinase e 40% apresentaram atividade proteolítica. Dos genes de virulência pesquisados, nenhum isolado tinha presente no seu genoma os genes agg e cylA, no entanto o gene esp estava presente em 19% dos isolados e gelE em 26%. Em suma, os resultados deste estudo comprovam que cada queijo analisado possui uma microbiota autóctone característica e relevante para as propriedades do produto final. Relativamente ao seu potencial de patogenicidade, foram identificados isolados resistentes a alguns antibióticos de importância clínica, sendo ainda identificada, capacidade hemolítica e proteolítica. O facto de existir apenas um isolado multirresistente diminui o potencial risco associado.
Main Authors:	Eusébio, Francisca Nascimento
Subject:	Queijo tradicional português Bactérias acido láticas Enterococcus spp. Resistência a antibióticos Fatores de virulência Teses de mestrado - 2020
Year:	2020
Country:	Portugal
Document type:	master thesis
Access type:	open access
Associated institution:	Universidade de Lisboa
Language:	Portuguese
Origin:	Repositório da Universidade de Lisboa

Description
Summary:	Os queijos de Nisa e Azeitão fazem parte da lista dos queijos portugueses com Denominação de Origem Protegida (DOP). Apesar de serem produzidos em regiões distintas, apresentam algumas semelhanças, tais como a utilização de leite de ovelha cru e o tipo de coalho (Cynara cardunculus). A produção destes queijos conta com a ação de bactérias ácido láticas que estão presentes no processo de fermentação e de maturação, tendo estas contribuições relevantes para as propriedades organoléticas do produto final. Estas bactérias, apesar de apresentarem inúmeras vantagens tecnológicas, podem ser veículos de transmissão de genes, tanto de resistência a antibióticos, como de fatores de virulência. Nesse contexto, esta dissertação teve como objetivo a caracterização microbiana de bactérias ácido láticas, particularmente Enterococcus spp., e a avaliação do seu potencial de patogenicidade. Por fim, a comparação entre os resultados obtidos no presente estudo e os obtidos ao longo dos anos 2016- 18. Durante o ano de 2019 foram recolhidos queijos produzidos em queijarias tradicionais de Azeitão e Nisa. A partir dessas amostras foram isoladas as bactérias ácido láticas, recorrendo a diferentes meios de cultura. De seguida, para a avaliação da diversidade microbiana dos isolados, foi aplicada a técnica de RAPD-PCR. A análise dos perfis obtidos permitiu a construção de dendrogramas e a partir destes foi possível avaliar a semelhança genómica entre os isolados, e consequentemente fazer a escolha dos representantes e calcular índices de diversidade. Os resultados obtidos para os queijos em análise, mostraram que os Lactococcus spp. são o grupo predominante, estando Enterococcus spp. presente em número mais reduzido, apesar da sua elevada diversidade genómica (demonstrada pelo cálculo dos índices de diversidade). Estes resultados foram concordantes com os obtidos em anos transatos. Uma análise mais detalhada dos enterococos, mostrou ser a espécie E. faecalis a predominante nos queijos DOP em estudo, seguida das espécies E. faecium e E. durans. Quanto à resistência a antibióticos, a mesma foi estudada com recurso a técnicas de difusão em disco e PCR-multiplex dirigido a determinantes de resistência. Foram observadas algumas diferenças no número de isolados resistentes ao longo dos anos de estudo. Enterococcus sp. mostraram ser resistentes à grande maioria dos antibióticos estudados e foi ainda identificado um isolado multirresistente. Em relação aos genes de resistência pesquisados, concluímos que 100% dos isolados resistentes à tetraciclina apresentam o gene tet(M), 67% dos isolados resistentes à eritromicina apresentam o gene erm(B) e, por fim, o isolado resistente à vancomicina não apresenta os genes van(A) ou van(B). Relativamente à pesquisa de fatores de virulência, verificou-se que 26% dos isolados apresentavam atividade positiva para a hemólise, uma percentagem bastante superior às obtidas em anos anteriores, 45% dos enterecocos demonstraram resultados positivos para a produção de gelatinase e 40% apresentaram atividade proteolítica. Dos genes de virulência pesquisados, nenhum isolado tinha presente no seu genoma os genes agg e cylA, no entanto o gene esp estava presente em 19% dos isolados e gelE em 26%. Em suma, os resultados deste estudo comprovam que cada queijo analisado possui uma microbiota autóctone característica e relevante para as propriedades do produto final. Relativamente ao seu potencial de patogenicidade, foram identificados isolados resistentes a alguns antibióticos de importância clínica, sendo ainda identificada, capacidade hemolítica e proteolítica. O facto de existir apenas um isolado multirresistente diminui o potencial risco associado.