Publicação

Prodrugs of weak acids with activity against M. tuberculosis

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A tuberculose é uma doença infecciosa que afecta milhões de pessoas em todo o mundo. Em 2015 foram relatados 9,6 milhões de novos casos. O agente infeccioso causador da doença, Mycobacterium tuberculosis, desenvolveu várias resistências aos tratamentos existentes. Esta bactéria possui um envelope celular bastante complexo, constituído por ácidos micólicos interferindo na sensibilidade da bactéria aos antiobióticos hidrofóbicos. Os tratamentos actualmente existentes consistem em combinações de fármacos de primeira linha (isoniazida, rifampicina, pirazinamida e ethambutol). No entanto, surgiram estirpes resistentes a alguns dos fármacos administrados no tratamento dando origem a outros dois tipos da doença: tuberculose multi-resistente e tuberculose extensivamente multi-resistente. Nestes casos o tratamento envolve outro tipo de fármacos: fármacos de 2ª e 3ª linha. Estes tipos de fármacos são mais dispendiosos e apresentam diversos efeitos secundários. Nos fármacos de 2ª linha, existe um grupo de fármacos que são as fluroquinolonas. Estes fármacos derivam do ácido nalidíxico e contêm fluor na sua estrutura, sendo activos contra um grande número de bactérias. Este grupo de compostos tem como alvo enzimas envolvidos no processo de transcrição do DNA, processo crucial para a vitalidade da bactéria. O ácido nalidíxico é uma quinolona usada normalmente no tratamento de infeções urinárias causadas por bactérias. Este antibiótico actua através da inibição do ADN girase, um enzima fulcral no processo de transcrição do ADN bacteriano. Estudos anteriores demonstraram que alguns ácidos fracos apresentam atividade antimicobacteriana contra Mycobacterium tuberculosis em virtude da sua acumulação no interior da célula, devido a um mecanismo de efluxo deficiente. Sendo o ácido nalidíxico um ácido fraco, alterações na sua estrutura poderão melhorar as suas propriedades farmacocinéticas bem como a sua activida antimicobacteriana. Os pró-fármacos são compostos que não são biologicamente activos, ou seja, necessitam de ser activados através de reações químicas ou enzimáticas. Este tipo de compostos é sintetizado quando a substância activa possui propriedades indesejadas, como baixa absorção, degradação rápida por parte de enzimas, deficiente entrada nas células das micobactérias, entre outras. Na preparação de um fármaco contra a tuberculose, é necessário que este apresente boas propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e excrecção, sendo ativo no local desejado e não tóxico contra o organismo humano. Neste sentido, é necessária a síntese de compostos estáveis à hidrólise por parte de enzimas, plasmáticos e hepáticos do hospedeiro, que penetrem a membrana celular da bacteria, portanto lipofílicos e que sejam activos contra a bactéria Mycobacterium tuberculosis. Para serem ativos, é necessário que os compostos sejam hidrolisados pelos enzimas da micobácteria, de forma a converter os pró-fármacos na sua forma activa. Por último, os derivados sintetizados devem apresentar níveis de toxicidade reduzidos para o hospedeiro. Uma das estratégias mais comuns na síntese de pró-fármacos é a formação de grupos éster pois estes grupos levam a um aumento da lipofilia do composto e consequentemente facilitam a sua passagem através das membranas biológicas. Estudos anteriores demonstraram que o Mycobacterium tuberculosis possui enzimas responsáveis pela hidrólise de ésteres. Neste trabalho foram sintetizados derivados do ácido nalidíxico (1). Os derivados sintetizados são ésteres pois estes são mais lipofílicos, e por isso penetrarão mais facilmente nas micobactérias que o ácido correspondente. Para que os compostos sejam ativos, é necessário que cheguem ao local de acção sem sofrer alterações na sua estrutura. Assim, é necessário que estes ésteres sejam resistentes à hidrólise por enzimas humanos e, por outro lado, susceptíveis à hidrólise por parte de enzimas micobacterianos. Os ésteres sintetizados apresentam diferentes cadeias alcoxílicas (entre 2 e 14 carbonos), de forma a estudar o efeito da lipofilia na estabilidade e actividade destes. Na porção acilo, foi feita uma substituição em relação ao ácido nalidíxico de forma a verificar se aquela porção da molécula tem influência na actividade do composto. Pretendeu-se avaliar se a substituição do grupo C7-CH3 pelo grupo C7-CCl3 levava a melhores resultados a nível de inibição do crescimento micobacteriano bem como se os compostos eram susceptíveis ou resistentes à hidrólise enzimática. De facto, estudos anteriores demonstram que aquela porção da molécula apresenta um papel crucial na actividade deste tipo de compostos. Para além de ésteres, foi sintetizado também um derivado do ácido carboxílico que continha apenas a substituição do grupo C7-CH3 pelo grupo C7-CCl3, de forma a testar a sua actividade bem como para controlo de ensaios de estabilidade. Na síntese de todos os derivados, dois métodos distintos foram usados e observou-se que os rendimentos eram bastante diferentes entre os dois grupos de ésteres: ésteres com o grupo C7-CH3 tiveram um rendimento de síntese acima dos 51% enquanto que ésteres com o grupo C7-CCl3 tiveram um rendimento de síntese inferior a 35%. Os estudos de actividade foram realizados na estirpe H37Rv de Mycobacterium tuberculosis. Nestes estudos, foram analisadas as concentrações mínimas necessárias para inibição de 90% e de pelo menos 50% do crescimento bacteriano. Também foi analisada a percentagem de inibição do crescimento bacteriano para uma concentração administrada de composto de 100 μM. Observou-se que praticamente todos os derivados do ácido nalidíxico inibem o crescimento micobacteriano. Para além disso, verificou-se que os derivados com o substituinte C7–CCl3 são mais activos, de um modo geral, que os derivados com o substituinte C7-CH3. Foram realizados estudos de estabilidade em plasma humano e em tampão fosfato pH 7,4. Os estudos em plasma humano permitiram observar se os compostos são susceptíveis à hidrólise enzimática por partes dos enzimas presentes neste compartimento corporal. Os ensaios em tampão fosfato pH 7,4 foram realizados de forma a avaliar a estabilidade química dos compostos. Verificou-se que os derivados sintetizados são muito resistentes à hidrólise química, bem como à hidrólise enzimática. De facto, os compostos apresentam tempos de semi-vida bastante elevados revelando-se muito estáveis. Os resultados obtidos demonstram que os compostos sintetizados apresentam tempos de semi-vida superiores a 2,8 dias, no caso da hidrólise enzimática, e 7,8 dias no caso da hidrólise química. Para além disso, no estudo da susceptibilidade à hidrólise enzimática, houve compostos que não demonstraram degradação durante as 72 horas do ensaio em plasma humano. Fez-se também uma comparação entre as constantes cinéticas da hidrólise enzimática e da hidrólise química para avaliar se a hidrólise química tem impacto nos estudos de estabilidade em plasma humano. Verificou-se que para alguns compostos este tipo de hidrólise não é significativa, porém, em alguns deles, esta apresenta um impacto semelhante ao da hidrólise enzimática. Com base neste estudo, pretende-se o desenvolvimento de novos pró-fármacos com actividade contra a tuberculose, de modo a combater as estirpes resistentes aos tratamentos atuais. Neste trabalho, foi possível concluir que os derivados ésteres desenvolvidos do ácido nalidíxico são muito estáveis à hidrólise enzimática bem como à hidrólise química. Verificou-se que os derivados que apresentam o substituinte C7–CCl3 são mais activos contra a estirpe estudada do que os compostos que apresentam o substituinte C7-CH3. Apesar de praticamente todos os derivados sintetizados apresentaram actividade contra a bacteria, alterações na sua estrutura são necessárias de modo a aumentar a inibição do crescimento bacteriano, a menores concentrações administradas, mas mantendo a estabilidade à hidrólise enzimática no hospedeiro. No futuro mais estudos com este tipo de derivados serão necessários, tais como, ensaios de toxicidade, estudos de modelação, estudos em homogenato de fígado, entre outros. Para além disso, é necessário compreender qual o mecanismo que leva à inibição do crescimento bacteriano por parte dos derivados do ácido nalidíxico sintetizados.
Autores principais:	Pratas, Ana Rita Narciso
Assunto:	Tuberculose Ácido nalidíxico Pró-fármacos Estabilidade Actividade Teses de mestrado - 2017
Ano:	2017
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A tuberculose é uma doença infecciosa que afecta milhões de pessoas em todo o mundo. Em 2015 foram relatados 9,6 milhões de novos casos. O agente infeccioso causador da doença, Mycobacterium tuberculosis, desenvolveu várias resistências aos tratamentos existentes. Esta bactéria possui um envelope celular bastante complexo, constituído por ácidos micólicos interferindo na sensibilidade da bactéria aos antiobióticos hidrofóbicos. Os tratamentos actualmente existentes consistem em combinações de fármacos de primeira linha (isoniazida, rifampicina, pirazinamida e ethambutol). No entanto, surgiram estirpes resistentes a alguns dos fármacos administrados no tratamento dando origem a outros dois tipos da doença: tuberculose multi-resistente e tuberculose extensivamente multi-resistente. Nestes casos o tratamento envolve outro tipo de fármacos: fármacos de 2ª e 3ª linha. Estes tipos de fármacos são mais dispendiosos e apresentam diversos efeitos secundários. Nos fármacos de 2ª linha, existe um grupo de fármacos que são as fluroquinolonas. Estes fármacos derivam do ácido nalidíxico e contêm fluor na sua estrutura, sendo activos contra um grande número de bactérias. Este grupo de compostos tem como alvo enzimas envolvidos no processo de transcrição do DNA, processo crucial para a vitalidade da bactéria. O ácido nalidíxico é uma quinolona usada normalmente no tratamento de infeções urinárias causadas por bactérias. Este antibiótico actua através da inibição do ADN girase, um enzima fulcral no processo de transcrição do ADN bacteriano. Estudos anteriores demonstraram que alguns ácidos fracos apresentam atividade antimicobacteriana contra Mycobacterium tuberculosis em virtude da sua acumulação no interior da célula, devido a um mecanismo de efluxo deficiente. Sendo o ácido nalidíxico um ácido fraco, alterações na sua estrutura poderão melhorar as suas propriedades farmacocinéticas bem como a sua activida antimicobacteriana. Os pró-fármacos são compostos que não são biologicamente activos, ou seja, necessitam de ser activados através de reações químicas ou enzimáticas. Este tipo de compostos é sintetizado quando a substância activa possui propriedades indesejadas, como baixa absorção, degradação rápida por parte de enzimas, deficiente entrada nas células das micobactérias, entre outras. Na preparação de um fármaco contra a tuberculose, é necessário que este apresente boas propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e excrecção, sendo ativo no local desejado e não tóxico contra o organismo humano. Neste sentido, é necessária a síntese de compostos estáveis à hidrólise por parte de enzimas, plasmáticos e hepáticos do hospedeiro, que penetrem a membrana celular da bacteria, portanto lipofílicos e que sejam activos contra a bactéria Mycobacterium tuberculosis. Para serem ativos, é necessário que os compostos sejam hidrolisados pelos enzimas da micobácteria, de forma a converter os pró-fármacos na sua forma activa. Por último, os derivados sintetizados devem apresentar níveis de toxicidade reduzidos para o hospedeiro. Uma das estratégias mais comuns na síntese de pró-fármacos é a formação de grupos éster pois estes grupos levam a um aumento da lipofilia do composto e consequentemente facilitam a sua passagem através das membranas biológicas. Estudos anteriores demonstraram que o Mycobacterium tuberculosis possui enzimas responsáveis pela hidrólise de ésteres. Neste trabalho foram sintetizados derivados do ácido nalidíxico (1). Os derivados sintetizados são ésteres pois estes são mais lipofílicos, e por isso penetrarão mais facilmente nas micobactérias que o ácido correspondente. Para que os compostos sejam ativos, é necessário que cheguem ao local de acção sem sofrer alterações na sua estrutura. Assim, é necessário que estes ésteres sejam resistentes à hidrólise por enzimas humanos e, por outro lado, susceptíveis à hidrólise por parte de enzimas micobacterianos. Os ésteres sintetizados apresentam diferentes cadeias alcoxílicas (entre 2 e 14 carbonos), de forma a estudar o efeito da lipofilia na estabilidade e actividade destes. Na porção acilo, foi feita uma substituição em relação ao ácido nalidíxico de forma a verificar se aquela porção da molécula tem influência na actividade do composto. Pretendeu-se avaliar se a substituição do grupo C7-CH3 pelo grupo C7-CCl3 levava a melhores resultados a nível de inibição do crescimento micobacteriano bem como se os compostos eram susceptíveis ou resistentes à hidrólise enzimática. De facto, estudos anteriores demonstram que aquela porção da molécula apresenta um papel crucial na actividade deste tipo de compostos. Para além de ésteres, foi sintetizado também um derivado do ácido carboxílico que continha apenas a substituição do grupo C7-CH3 pelo grupo C7-CCl3, de forma a testar a sua actividade bem como para controlo de ensaios de estabilidade. Na síntese de todos os derivados, dois métodos distintos foram usados e observou-se que os rendimentos eram bastante diferentes entre os dois grupos de ésteres: ésteres com o grupo C7-CH3 tiveram um rendimento de síntese acima dos 51% enquanto que ésteres com o grupo C7-CCl3 tiveram um rendimento de síntese inferior a 35%. Os estudos de actividade foram realizados na estirpe H37Rv de Mycobacterium tuberculosis. Nestes estudos, foram analisadas as concentrações mínimas necessárias para inibição de 90% e de pelo menos 50% do crescimento bacteriano. Também foi analisada a percentagem de inibição do crescimento bacteriano para uma concentração administrada de composto de 100 μM. Observou-se que praticamente todos os derivados do ácido nalidíxico inibem o crescimento micobacteriano. Para além disso, verificou-se que os derivados com o substituinte C7–CCl3 são mais activos, de um modo geral, que os derivados com o substituinte C7-CH3. Foram realizados estudos de estabilidade em plasma humano e em tampão fosfato pH 7,4. Os estudos em plasma humano permitiram observar se os compostos são susceptíveis à hidrólise enzimática por partes dos enzimas presentes neste compartimento corporal. Os ensaios em tampão fosfato pH 7,4 foram realizados de forma a avaliar a estabilidade química dos compostos. Verificou-se que os derivados sintetizados são muito resistentes à hidrólise química, bem como à hidrólise enzimática. De facto, os compostos apresentam tempos de semi-vida bastante elevados revelando-se muito estáveis. Os resultados obtidos demonstram que os compostos sintetizados apresentam tempos de semi-vida superiores a 2,8 dias, no caso da hidrólise enzimática, e 7,8 dias no caso da hidrólise química. Para além disso, no estudo da susceptibilidade à hidrólise enzimática, houve compostos que não demonstraram degradação durante as 72 horas do ensaio em plasma humano. Fez-se também uma comparação entre as constantes cinéticas da hidrólise enzimática e da hidrólise química para avaliar se a hidrólise química tem impacto nos estudos de estabilidade em plasma humano. Verificou-se que para alguns compostos este tipo de hidrólise não é significativa, porém, em alguns deles, esta apresenta um impacto semelhante ao da hidrólise enzimática. Com base neste estudo, pretende-se o desenvolvimento de novos pró-fármacos com actividade contra a tuberculose, de modo a combater as estirpes resistentes aos tratamentos atuais. Neste trabalho, foi possível concluir que os derivados ésteres desenvolvidos do ácido nalidíxico são muito estáveis à hidrólise enzimática bem como à hidrólise química. Verificou-se que os derivados que apresentam o substituinte C7–CCl3 são mais activos contra a estirpe estudada do que os compostos que apresentam o substituinte C7-CH3. Apesar de praticamente todos os derivados sintetizados apresentaram actividade contra a bacteria, alterações na sua estrutura são necessárias de modo a aumentar a inibição do crescimento bacteriano, a menores concentrações administradas, mas mantendo a estabilidade à hidrólise enzimática no hospedeiro. No futuro mais estudos com este tipo de derivados serão necessários, tais como, ensaios de toxicidade, estudos de modelação, estudos em homogenato de fígado, entre outros. Para além disso, é necessário compreender qual o mecanismo que leva à inibição do crescimento bacteriano por parte dos derivados do ácido nalidíxico sintetizados.