The influence of epilepsy in synaptic plasticity in the hippocampus: neuroprotective role of VIP and its receptors

• Author(s): Cruz, Armando Dulcídio da Silva
• Date: 2010
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/4546
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): VIP; LTP; VPAC1; Interneurónios; PKA; Epilepsia; Teses de mestrado - 2010
• Document Type: Master thesis
• Language: English
• Advisor(s): Reis, Diana Lina Jerónimo da Cunha, 1973-; Almeida, Rodrigo Freire Martins de
• Contributor(s): Repositório da Universidade de Lisboa

Description

Tese de mestrado, Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009

O VIP (do Inglês ‘vasoactive intestinal peptide’) e um péptido neuromodulador que se encontra largamente distribuído no sistema nervoso central e periférico e tem um papel determinante em muitas acções biológicas em mamíferos. No hipocampo, é expresso exclusivamente em interneurónios, sugerindo um envolvimento na regulação da transmissão GABAergica (GABA, do ingles ‘γ-Aminobutyric acid’) do hipocampo. O hipocampo é uma estrutura cerebral envolvida fundamentalmente na formação e associação de memórias e orientação espacial. Apresenta um circuito neuronal unidireccional constituído por três áreas principais: giros dentado, com células granulares a constituírem a principal camada (stratum granulosum); area cornu Ammonis 3 (CA3), enervada pelos axónios das células granulares do giros dentado e constituída por uma camada principal de células piramidais (stratum piramidales); área cornu Ammonis 1 (CA1), também constituída por uma camada de células piramidais e enervada pelos axónios projectados da região CA3. Associado às células principais excitatorias esta um sistema complexo de interneurónios inibitórios GABAergicos. Os interneurónios estão envolvidos na regulação do ritmo teta no hipocampo, ritmo relacionado com a aprendizagem. Segundo a classificação de Somogyi e Klausberger existem vários tipos de interneurónios, mas apenas três tipos de interneurónios expressam VIP, sendo estas as únicas células que expressam VIP no hipocampo. Duas das populações de interneurónios que expressam VIP tem como alvo outros interneurónios, que são por sua vez responsáveis pela inibição das dendrites das células piramidais. A outra população (composta por interneurónios denominados células ‘basket’) enerva preferencialmente o corpo celular das células piramidais. Isto sugere que o VIP pode modular a transmissão sináptica para as células piramidais por duas vias alternativas. O VIP actua através da activação de dois receptores selectivos de afinidades semelhantes, o VPAC1 e o VPAC2, acoplados a proteínas G. Estudos previos utilizando técnicas de imunohistoquímica, autorradiografia e hibridização in situ, revelaram que estes receptores têm uma distribuição não homogénea pelas diferentes camadas no hipocampo. Os receptores VPAC1 situam-se principalmente no stratum oriens e radiatum do CA1, enquanto que os receptores VPAC2 se encontram principalmente no stratum piramidale. Portanto, os receptores VPAC1 encontram-se em pontos onde se situam as sinapses dos interneurónios que expressam VIP que tem como alvo outros interneurónios, sugerindo um papel regulador destes receptores na área CA1. Os receptores VPAC2 localizamse nas zonas de contacto entre células ‘basket’ e as células piramidais. No Sistema nervoso central e necessário existir um equilíbrio entre a actividade excitatória e inibitória, a transmissão glutamatérgica e a transmissão GABAergica, caso contrario gera-se uma alteração na actividade eléctrica do cérebro (convulsões), designada por epilepsia. A epilepsia do lobo temporal (TLE, do inglês ‘Temporal Lobe Epilepsy’) e a forma mais comum e tem como consequências dificuldade de aprendizagem e perda de interneurónios no hipocampo. Observou-se, quer em pacientes quer em modelos animais da doença, que há um aumento do VIP endógeno e dos seus receptores no hipocampo. Em estudos prévios no nosso laboratório observou-se que o VIP inibe a potenciação de longa duração (LTP, do inglês ’Long-Term Potentiation’) através da activação dos receptores VPAC1, sendo que a LTP e o modelo in vitro mais aproximado no estudo da memoria. Sabendo que a cináse A de proteínas (PKA, do inglês ‘Protein kinase A’) e importante na formação de memórias de longa duração e que a modulação da memoria pelo VIP no hipocampo foi associada a selecção de memórias de longa duração, o objectivo deste trabalho foi investigar: 1) o envolvimento da PKA na LTP de fase tardia, 2) o envolvimento dos receptores VPAC1 na LTP de fase tardia, e ainda 3) a influência das convulsões in vitro de epilepsia na LTP. Para tal utilizaram-se fatias de hipocampo de ratos jovens (6-7 semanas) e jovens adultos (12-13 semanas) e efectuaram-se registos extracelulares de potenciais excitatórios pós-sinápticos evocados (fEPSPs, do inglês ‘evoked field excitatory postsynaptic potentials’). Foi estimulada a área CA1 no stratum radiatum, ou seja, sobre as fibras colaterais de Schaffer e registaram-se os fEPSPs também no stratum radiatum na zona de contacto entre as fibras colaterais de Schaffer e as dendrites das células piramidais. Foi induzida a late-LTP por estimulação θ–burst utilizando dois protocolos de estimulação diferentes:, strong θ-burst (15x4 pulsos de 100Hz separados por 200ms, durante 3 segundo) e late-LTP θ-burst (3 estímulos strong θ-burst com 6 minutos de intervalo). Usou-se a estimulação weak θ-burst (5x4 pulsos a 100Hz separados por 200ms, durante 1 segundo) como controlo. O efeito na potenciação foi avaliado ao fim de uma hora para todos os protocolos anteriores e ao fim de duas horas para o late-LTP θ-burst. A Late-LTP e uma LTP com uma fase mais tardia, caracterizada no seu todo pela sua persistência de varias horas e dependência de PKA sendo um melhor modelo in vitro para estudo da memoria, Para avaliar a influencia da PKA e dos receptores VPAC1 na Late-LTP induzida por estimulação θ-burst, foram utilizados os inibidores do PKA, H-89 e PKI 14-22 amida, e o antagonista selectivo dos receptores VPAC1 (PG 97-269). A influência do modelo in vitro de convulsões na plasticidade sináptica, foi avaliada em fatias de hipocampo de rato de 6 semanas de idade com uma pre-incubação de bicuculina (50 μM) durante 30 minutos seguido de uma hora de lavagem. Em seguida foi induzida a LTP utilizando o protocolo de estimulação strong θ-burst, sendo avaliado o efeito na potenciação ao fim de uma hora. A aplicação do H-89 (1 μM) e do PKI 14-22 amida (1 μM), 20 minutos antes da indução da LTP com o protocolo strong θ-burst em fatias de hipocampo em ratos jovens adultos, não alterou a potenciação quando comparando com a condição controlo (Controlo - H-89: 65,2 ± 10%, n = 4; H-89: 64,4± 1,5% n = 4; Controlo - PKI: 69,8± 15,5%, n = 3; PKI 14-22 amida: 61,8 ± 4,4%, n = 3). A perfusão do H-89 (1 e 3 μM) e do PKI 14-22 amida (1 μM), 20 minutos antes da indução da LTP com late-LTP θ-burst em ratos jovens adultos, não alterou a potenciação quando comparando com a condição controlo (Controlo: 80,5 ± 8,3%, n = 7, H-89 1μM: 74,2 4,5%, n = 2, H-89 3 μM: n 76,2± 9,7%, = 5; PKI 14-22 amida: 75,0 ± 1,5%, n = 2). Estes resultados sugerem que a LTP, induzida tanto pelo protocolo strong θ-burst como pelo protocolo late-LTP θ-burst, e independente do PKA. O papel dos receptores VPAC1 na LTP foi avaliado com o antagonista do receptor VPAC1 (PG 97-269). A aplicação do PG 97-269 (100 nM) no banho, 20 minutos antes da indução da LTP com o protocolo strong θ-burst em fatias de hipocampo de ratos de 12 semanas de idade, diminuiu a potenciação em 20% quando comparando a condição controlo (Controlo: 67,1 ± 5,6%, n = 5; PG 97-269: n 53,4 ± 4,8%, = 5, p <0,05) e com uma maior concentração de PG 97-269 (300 nM), o efeito foi similar (Controlo: n 44,9 ± 8,2% = 3; PG 97-269: 37,1 ± 13,4%, n = 2). Quando se avaliou a influência da intensidade do protocolo utilizado e da idade dos animais, a aplicação do PG 97-269 (100 nM), 20 minutos antes da indução da LTP com o protocolo weak θ-burst em ratos de 12 semanas, aumentou a potenciação quando comparando com a condição controlo (Controlo: 44,0 ± 0,2%, n = 3; PG 97-269: 59,7 ± 11,5%, n = 3) e usando um protocolo strong θ-burst em ratos de 6 semanas, o efeito foi similar (Controlo: 35,2 ± 6,6 %, n = 6; PG 97-269: 46,4 ± 4,5%, n = 6, p <0,05). A aplicação de PG 97- 269 (100 nM), 20 minutos antes da indução da LTP com o protocolo late-LTP θ-burst em ratos de 12 semanas, diminui a potenciação quando comparando com a condição controlo (Controlo: 80,5 ± 8,3%, n = 7, H-89 1μM: 93,9 ± 7,8%, n = 2). Estes resultados sugerem que a activação dos receptores VPAC1 leva a uma diminuição da LTP, excepto quando aplicado um protocolo de estimulação forte (strong θ-burst e late-LTP θ-burst) em ratos de 12 semanas, em que se observa um aumento da LTP pela activação dos receptores VPAC1. A potenciação obtida no estudo da influencia da actividade epileptiforme in vitro na LTP (46,4 ± 8,9%, n = 2) em fatias tratadas foi semelhante quando comparada com a condição controle (sem tratamento). A temperatura utilizada na condição teste foi superior, sendo por isso impossível tirar qualquer conclusão quantitativa da relação mas os resultados sugerem que a LTP será menor, dado que o aumento de temperatura leva a um aumento da transmissão sináptica. Em suma, estes resultados sugerem que a LTP induzida por estimulação teta e independente da PKA e o papel do receptor VPAC1 na LTP induzida por um protocolo teta não é clara. Sendo por isso necessários mais estudos sobre a modulação do VIP endógeno na LTP para uma melhor compreensão do papel dos receptores VPAC1 na LTP no hipocampo, porque passados 40 anos após a descoberta do VIP por Mutt e Said, o papel do VIP na transmissão sináptica no hipocampo continua incerto. Ainda assim, os dados obtidos nesta tese sugerem que a modulação pelo VIP poderá funcionar como um filtro na expressão da LTP.

Activation of VPAC1 receptors by endogenous VIP, a known modulator of synaptic transmission to hippocampal CA1 pyramidal cells, was recently reported to inhibit long-term potentiation (LTP) induced by θ-burst stimulation in young adult rats. The role of endogenous VIP in the modulation of late-LTP was never evaluated either in healthy or epileptic adult rats. The influence of VPAC1 receptor activation by endogenous VIP on late-LTP was examined in the CA1 area of young (6-7 weeks) and adult (12-13 weeks) rat hippocampal slices. Late-LTP was induced by strong θ-burst or late-LTP θ-burst (a weak θ-burst was used as control) and potentiation of fEPSP slope evaluated one hour (all protocols) and two hours (late-LTP protocol) later. To select a LTP protocol that would induce a stable late-LTP, lasting for several hours and PKA-dependent, resembling memory formation processes, we studied the involvement of PKA on these late-LTPs. The influence of in vitro epileptiform activity on LTP was studied in 6-week-old rat hippocampal slices pre-treated with bicuculline (50 μM, 30 min). Late-LTP was induced one hour after bicuculline washout using a strong θ-burst protocol. PKA inhibitors (H-89 and PKI 14-22 amide) did not change the potentiation obtained for any of the θ-burst stimulation protocols in 12 week-old rats. The presence of the selective VPAC1 antagonist PG 97-269 during the strong θ-burst protocol: 1) decreased the potentiation in 12-week-old rats; 2) increased the potentiation in 6 week-old rats. With the weak θ-burst protocol, the presence of PG 97-269 (100nM) increased the potentiation for both age groups. When studying LTP induced by strong θ-burst protocol one hour after in vitro epileptiform activity the potentiation was not changed. Together, these results suggest that the late-LTP induced by different θ-burst protocols is PKA independent and that the role of VPAC1 receptors on these late-LTPs varied with the experimental conditions.